Le système de coupe de gènes peut jouer un deuxième rôle en tant que variateur génétique

Dans une série d’expériences avec des bactéries cultivées en laboratoire, les scientifiques de Johns Hopkins ont trouvé des preuves que le système de coupe de gène CRISPR-Cas9, largement utilisé, joue un rôle secondaire – en tant que gradateur génétique pour les gènes CRISPR-Cas9. Son rôle de numérotation vers le bas ou d’atténuation de l’activité CRISPR-Cas9 peut aider les scientifiques à développer de nouvelles façons de concevoir des cellules génétiquement à des fins de recherche.

Un résumé des résultats a été publié le 8 janvier dans Cellule.

Identifié pour la première fois dans le génome des bactéries intestinales en 1987, CRISPR-Cas9 est un groupe de gènes d’origine naturelle mais inhabituelle avec un potentiel de coupure des séquences d’ADN dans d’autres types de cellules qui a été réalisé 25 ans plus tard. Sa valeur en génie génétique – altération génique programmable dans les cellules vivantes, y compris les cellules humaines – a été rapidement appréciée, et son utilisation généralisée comme « éditeur » du génome dans des milliers de laboratoires à travers le monde a été reconnue dans l’attribution du prix Nobel de chimie. année à ses co-développeurs américains et français.

CRISPR signifie de courtes répétitions palindromiques groupées, régulièrement espacées. Cas9, qui fait référence à la protéine 9 associée à CRISPR, est le nom de l’enzyme qui produit la tranche d’ADN. Les bactéries utilisent naturellement CRISPR-Cas9 pour couper l’ADN viral ou autre ADN potentiellement nocif et désactiver la menace, déclare Joshua Modell, Ph.D., professeur adjoint de biologie moléculaire et de génétique à la Johns Hopkins University School of Medicine.

CRISPR n’est pas seulement un système immunitaire, c’est un système immunitaire adaptatif – un système qui peut se souvenir des menaces qu’il a déjà rencontrées en conservant un petit morceau de leur ADN, qui s’apparente à un coup de gueule. « 

Joshua Modell, Ph.D., professeur adjoint de biologie moléculaire et de génétique, École de médecine de l’Université Johns Hopkins

Ces clichés de tasse sont ensuite copiés dans des «ARN guides» qui indiquent à Cas9 quoi couper.

Les scientifiques ont longtemps travaillé pour démêler les étapes précises du mécanisme de CRISPR-Cas9 et comment son activité dans les bactéries est augmentée ou diminuée. À la recherche de gènes qui enflamment ou inhibent le système de coupe de gène CRISPR-Cas9 pour la bactérie Streptococcus pyogenes, commune causant l’angine streptococcique, les scientifiques de Johns Hopkins ont trouvé un indice sur le fonctionnement de cet aspect du système.

Plus précisément, les scientifiques ont découvert un gène dans le système CRISPR-Cas9 qui, lorsqu’il est désactivé, a conduit à une augmentation spectaculaire de l’activité du système chez les bactéries. Le produit de ce gène a semblé reprogrammer Cas9 pour qu’il agisse comme un frein, plutôt que comme un «ciseau», pour régler le système CRISPR.

« Du point de vue de l’immunité, les bactéries doivent intensifier l’activité CRISPR-Cas9 pour identifier et débarrasser la cellule des menaces, mais elles doivent également la réduire pour éviter l’auto-immunité – lorsque le système immunitaire attaque par erreur les composants des bactéries elles-mêmes », dit l’étudiante diplômée Rachael Workman, bactériologiste travaillant dans le laboratoire de Modell.

Pour mieux préciser les particularités du «frein», la prochaine étape de l’équipe a été de mieux comprendre le produit du gène désactivé (tracrRNA). L’ARN est un cousin génétique de l’ADN et est essentiel à l’exécution des «instructions» de l’ADN pour la fabrication des protéines. Les TracrARN appartiennent à une famille unique d’ARN qui ne produisent pas de protéines. Au lieu de cela, ils agissent comme une sorte d’échafaudage qui permet à l’enzyme Cas9 de transporter l’ARN guide qui contient le mug shot et de couper les séquences d’ADN correspondantes dans les virus envahisseurs.

TracrRNA est disponible en deux tailles: longue et courte. La plupart des outils modernes CRISPR-Cas9 de découpe génétique utilisent la forme courte. Cependant, l’équipe de recherche a découvert que le produit génique désactivé était la forme longue du tracrARN, dont la fonction était totalement inconnue.

Les formes longues et courtes de tracrRNA ont une structure similaire et ont en commun la capacité de se lier à Cas9. Le tracrRNA de forme courte se lie également à l’ARN guide. Cependant, le tracrRNA de forme longue n’a pas besoin de se lier à l’ARN guide, car il contient un segment qui imite l’ARN guide. «Essentiellement, les tracrARN de forme longue ont combiné la fonction du tracrARN de forme courte et de l’ARN guide», explique Modell.

En outre, les chercheurs ont découvert que si les ARN guides recherchent normalement des séquences d’ADN viral, les tracrARN de forme longue ciblent le système CRISPR-Cas9 lui-même. Le tracrARN de forme longue a tendance à reposer sur l’ADN plutôt que de le couper. Lorsque cela se produit dans une zone particulière d’un gène, cela empêche ce gène de s’exprimer ou de devenir fonctionnel.

Pour confirmer cela, les chercheurs ont utilisé le génie génétique pour modifier la longueur d’une certaine région dans un tracrRNA de forme longue afin de faire ressembler le tracrRNA à un ARN guide. Ils ont constaté qu’avec le tracrRNA de forme longue modifiée, Cas9 se comportait à nouveau plus comme un ciseau.

D’autres expériences ont montré que dans les bactéries cultivées en laboratoire avec une quantité abondante de tracrARN de forme longue, les niveaux de tous les gènes liés à CRISPR étaient très faibles. Cependant, lorsque le tracrARN de forme longue a été retiré des bactéries, l’expression des gènes CRISPR-Cas9 a été multipliée par cent.

Les cellules bactériennes dépourvues du tracrRNA de forme longue ont été cultivées en laboratoire pendant trois jours et comparées à des cellules cultivées de manière similaire contenant le tracrRNA de forme longue. À la fin de l’expérience, les bactéries sans tracrRNA à forme longue étaient complètement mortes, ce qui suggère que le tracrRNA à forme longue protège normalement les cellules de la maladie et de la mort qui se produisent lorsque l’activité de CRISPR-Cas9 est très élevée.

«Nous avons commencé à avoir l’idée que le formulaire long réprimait mais n’éliminait pas sa propre activité liée à CRISPR», explique Workman.

Pour voir si le tracrRNA de forme longue pouvait être reprogrammé pour réprimer d’autres gènes bactériens, l’équipe de recherche a modifié la région d’espacement du tracrRNA de forme longue pour le laisser reposer sur un gène qui produit une fluorescence verte. Les bactéries avec cette version mutée du tracrRNA de forme longue brillaient moins en vert que les bactéries contenant le tracrRNA de forme longue normale, ce qui suggère que le tracrRNA de forme longue peut être génétiquement modifié pour sélectionner d’autres gènes bactériens.

Une autre équipe de recherche, de l’Université Emory, a découvert que dans la bactérie parasite Francisella novicida, Cas9 se comporte comme un gradateur pour un gène en dehors de la région CRISPR-Cas9. Le système CRISPR-Cas9 de l’étude Johns Hopkins est plus largement utilisé par les scientifiques comme outil de coupe de gènes, et les résultats de l’équipe de Johns Hopkins prouvent que l’action du gradateur contrôle le système CRISPR-Cas9 en plus d’autres gènes.

Les chercheurs ont également découvert les composants génétiques du tracrARN de forme longue dans environ 40% du groupe de bactéries Streptococcus. Une étude plus approfondie des souches bactériennes qui n’ont pas le tracrRNA de forme longue, dit Workman, révélera potentiellement si leurs systèmes CRISPR-Cas9 sont intacts et d’autres moyens par lesquels les bactéries peuvent rappeler le système CRISPR-Cas9.

La capacité de gradation que les expériences ont découverte, dit Modell, offre des opportunités de concevoir de nouveaux ou meilleurs outils CRISPR-Cas9 visant à réguler l’activité des gènes à des fins de recherche. «Dans un scénario d’édition de gène, un chercheur peut vouloir couper un gène spécifique, en plus d’utiliser la forme longue tracrRNA pour inhiber l’activité du gène», dit-il.