L'hypothèse du « monde de l'ARN » propose que la vie la plus ancienne sur Terre ait pu être basée sur l'ARN – ; une molécule simple brin similaire à bien des égards à l'ADN – ; comme certains virus modernes. En effet, comme l’ADN, l’ARN peut transporter des informations génétiques, mais, comme une protéine, il peut également agir comme une enzyme, déclenchant ou accélérant des réactions. Tandis que l'activité de quelques enzymes d'ARN – ; appelés ribozymes – ; ont été testés au cas par cas, il y en a des milliers d'autres dont l'existence a été prédite par ordinateur dans des organismes allant des bactéries aux plantes et aux animaux. Désormais, une nouvelle méthode, développée par des chercheurs de Penn State, permet de tester l'activité de milliers de ces ribozymes prédits en une seule expérience.
L'équipe de recherche a testé l'activité de plus de 2 600 séquences d'ARN différentes censées appartenir à une classe d'enzymes d'ARN appelées « ribozymes twister », qui ont la capacité de se couper en deux. Environ 94 % des ribozymes testés étaient actifs et l’étude a révélé que leur fonction peut persister même lorsque leur structure contient de légères imperfections. L’équipe de recherche a également identifié le premier exemple de ribozyme twister chez les mammifères, en particulier dans le génome du grand dauphin.
Un article décrivant l'étude a été publié en ligne aujourd'hui, le 5 novembre, dans la revue Recherche sur les acides nucléiques.
« Alors que l'ADN est une molécule double brin qui forme généralement une structure hélicoïdale simple, l'ARN est simple brin et peut se replier sur lui-même, formant diverses structures, notamment des boucles, des renflements et des hélices », a déclaré Phil Bevilacqua, professeur distingué de chimie et de biochimie et biologie moléculaire au Eberly College of Science de Penn State et chef de l'équipe de recherche.
La fonction des enzymes ARN est basée sur ces structures et elles ont été classées en plusieurs classes différentes. Nous avons choisi de nous concentrer sur ce que l'on appelle les « ribozymes twister » car l'une de leurs fonctions est de se diviser en deux, ce que nous pouvons voir en déterminant leur séquence génétique. »
Phil Bevilacqua, professeur émérite, Eberly College of Science, Pennsylvania State University
Avant cette étude, environ 1 600 ribozymes twister avaient été proposés sur la base de leur séquence génomique et des prédictions de leur structure, mais seule une poignée avait été validée expérimentalement. L'équipe a développé un pipeline expérimental qui leur a permis d'évaluer l'activité d'auto-clivage de milliers de ces ribozymes en une seule expérience, qu'ils appellent « essai de clivage à haut débit » ou CHiTA. Ils ont également identifié environ 1 000 candidats ribozymes twister supplémentaires en effectuant une recherche manuelle méticuleuse dans le contexte génomique autour d’une séquence courte et hautement conservée partagée par de nombreux ribozymes dans les génomes de milliers d’organismes.
CHiTA s’appuie sur deux facteurs clés. L’une est une technologie récemment développée appelée « synthèse massivement parallèle d’oligonucléotides » ou MPOS. MPOS donne à l'équipe de recherche la possibilité de concevoir puis d'acheter des milliers de séquences diverses de ribozymes sous la forme de petits morceaux d'ADN, le tout dans un seul flacon. Chacune des séquences qu'ils conçoivent a pour noyau l'une des 2 600 séquences de ribozymes prédites. Les chercheurs ajoutent ensuite de courts morceaux d’ADN à chaque extrémité qui leur permettent de faire des copies de l’ADN et de le transcrire en ARN pour tester son activité.
« Avec MPOS, nous pouvons simplement créer une feuille de calcul avec les séquences qui nous intéressent, l'envoyer à un fournisseur commercial, qui nous renvoie un tube contenant une petite quantité de chaque séquence », a déclaré Lauren McKinley, une étudiante diplômée. à Penn State au moment de la recherche, qui a récemment obtenu un doctorat et premier auteur de l'article. « Pour CHiTA, nous avons besoin de beaucoup de chaque séquence, nous ajoutons donc des morceaux d'ADN à chaque extrémité des séquences, ce qui nous permet d'en faire des millions de copies en utilisant une technique appelée PCR, mais ces bits supplémentaires pourraient avoir un impact sur notre capacité à tester le fonctions des ribozymes.
Le deuxième facteur clé pour CHiTA aide à surmonter cet obstacle en supprimant ces morceaux de séquence ajoutés à l'aide d'une protéine – ; appelé une enzyme de restriction – ; qui coupe l'ADN au niveau de courtes séquences spécifiques appelées sites de reconnaissance. Cependant, la plupart des enzymes de restriction coupent l'ADN quelque part près du milieu de leurs sites de reconnaissance, laissant une partie de la séquence du site de reconnaissance attachée aux deux fragments d'ADN résultants qui pourraient encore avoir un impact sur la structure et la fonction du ribozyme.
« Nous avons trouvé une enzyme de restriction qui coupe l'ADN à une courte distance de son site de reconnaissance, afin que nous puissions concevoir nos séquences de manière à ce qu'elle coupe ne laissant aucune trace d'ADN supplémentaire », a déclaré McKinley. « De cette façon, nous pourrions nous assurer que nous évaluions la fonction de la séquence précise des ribozymes. »
En laboratoire, l’équipe réalise d’abord des copies supplémentaires des séquences commandées via MPOS, coupe tout ADN supplémentaire avec l’enzyme de restriction, puis peut transcrire l’ARN des séquences d’ADN. Si l’une des séquences code pour des ribozymes actifs, au fur et à mesure que l’ARN est produit, elle se repliera rapidement dans sa structure fonctionnelle et se clivera. Les chercheurs peuvent alors collecter l'ARN et le reconvertir en ADN – ; appelé ADNc – ; afin qu'ils puissent lire sa séquence pour voir si elle est complète ou si elle a été clivée.
« Lorsque nous séquençons l'ADNc, nous pouvons voir quelle quantité d'ARN, le cas échéant, a été clivée, ce qui constitue un indicateur de l'activité du ribozyme », a déclaré McKinley. « Pour environ 94 % des séquences que nous avons testées, une partie importante de l'ARN a été clivée. En fait, le pourcentage de chaque ribozyme actif clivé est assez similaire aux efforts antérieurs qui testaient les ribozymes individuellement. »
L’équipe a ensuite examiné les structures prédites des séquences testées et a constaté que beaucoup d’entre elles présentaient de légères variations ou imperfections par rapport à la structure canonique du ribozyme twister, mais qu’elles étaient toujours auto-clivées. Cela suggère aux chercheurs que la fonction des ribozymes est très tolérante à de légers changements structurels, ce qui signifie qu'ils pourraient toujours fonctionner même s'ils ne sont pas parfaitement formés.
La tolérance aux imperfections suggère qu'il pourrait y avoir davantage de tornades cachées dans la nature qui ne pourraient pas être trouvées à l'aide des paramètres de recherche d'origine, selon l'équipe. En fait, de nouveaux descripteurs basés sur les séquences de cette étude ont conduit l’équipe de recherche à découvrir le premier ribozyme twister de mammifère, identifié dans le génome du grand dauphin.
« Comprendre ces types de tolérances à la séquence et aux variations structurelles des ribozymes nous aidera à concevoir de nouvelles méthodes rigoureuses pour les identifier », a déclaré Bevilacqua. « Nos connaissances actuelles sur la fonction des ribozymes reposent principalement sur la chimie, et nous commençons tout juste à en apprendre davantage sur leur rôle en biologie. Pouvoir tester leur activité dans un test à grande échelle comme CHiTA accélérera, espérons-le, notre capacité à trouver de nouveaux ribozymes. et mieux comprendre le rôle qu'ils jouent dans la cellule. Tout cela peut également nous aider à remonter le temps pour voir ce qui aurait pu être possible lorsque la capacité de l'ARN à tout faire aurait pu être la clé du redémarrage de la vie sur la Terre primitive. «
