Dans une étude récente publiée dans Biologie des communicationsles chercheurs ont étudié les conformations ouvertes et fermées du C-terminal de la protéine nucléocapside (N) du coronavirus du syndrome respiratoire aigu sévère 2 (SRAS-CoV-2) appelée NCDT. De plus, ils ont dérivé la structure cristalline du NCDT en complexe avec la guanine triphosphate (GTP).
Sommaire
Arrière plan
Un tiers du génome du SRAS-CoV-2 contient des cadres de lecture ouverts (ORF) pour la pointe (S), la membrane (M), l’enveloppe (E), N et d’autres protéines accessoires. Parmi ces protéines SARS-CoV-2, N renforce l’efficacité de sa transcription et de son assemblage. Son NCDT lie l’acide ribonucléique génomique (ARNg) et interagit avec la protéine SARS-CoV-2 M ; par conséquent, des études ont impliqué le NCDT pour interagir avec un signal d’emballage conservé (PS) requis pour l’emballage de l’ARN du SRAS-CoV-2. Cependant, des études antérieures n’ont pas élucidé la spécificité du PS, les constituants ARN du NCDT et leur processus de reconnaissance.
À propos de l’étude
Dans la présente étude, les chercheurs ont décrit le SARS-CoV-2 NCDT structures montrant son noyau alpha-hélicoïdal avec une épingle à cheveux β saillante utilisée pour la dimérisation. De plus, ils ont caractérisé le SARS-CoV-2 NCDT-Complexe binaire GTP.
Les auteurs ont émis l’hypothèse qu’un résidu tryptophane hautement conservé W330 dans le NCDT pourrait être un résidu d’acide aminé (AA) approprié pour la reconnaissance de l’ARN. Il pourrait interagir avec les fractions phosphate via un empilement π – π avec la base azotée. En outre, l’équipe a caractérisé la liaison du GTP en solution à l’aide de la fluorescence intrinsèque du tryptophane.
Pour confirmer que la fluorescence du résidu W301 AA était également activable, l’équipe a fabriqué un mutant NCTD-W330A, en remplaçant W330 par de l’alanine. En outre, ils ont déterminé l’extinction de la fluorescence en l’absence ou en présence de 0,5 millimolaire (mM) de GTP. Ils ont également réalisé des expériences de fluorimétrie différentielle à balayage (DSF) avec NCDT et nCTD-W330A en présence ou en l’absence de GTP 5 mM. De plus, les chercheurs ont utilisé la thermophorèse à micro-échelle (MST) pour mesurer l’affinité de liaison (Kré) pour le GTP du NCDT et nCTD-W330A. Enfin, ils ont analysé la liaison du NCDT à un oligonucléotide d’ARN dérivé de la région apicale de la tige-boucle 5a (SL5a) de l’ARNg du SRAS-CoV-2.
Résultats de l’étude
L’unité cristallographique asymétrique du SARS-CoV-2 NCDT avait deux homodimères et cinq hélices α (α1–α5). Une superposition de ses sous-unités a montré un mouvement en épingle à cheveux β de ≈5,5 angströms (Å). Une sous-unité présentait l’épingle à cheveux β dans une conformation étendue, appelée «ouverte», et l’autre dans une conformation fléchie, appelée «fermée». La troisième conformation en épingle à cheveux β a été impliquée dans le déplacement structurel de la boucle entre les résidus AA 280 à 283 situés entre α1 et α2. Une rotation de 180 ° de la chaîne latérale du résidu AA W330 vers l’épingle à cheveux β a rendu les interactions hydrophobes avec la chaîne latérale des résidus AA S327 et T325, et cela a changé la conformation en épingle à cheveux β d’ouverte à fermée en faveur de l’interaction interdimérique .
Seul le GTP co-cristallisé avec NCDT , formant une structure binaire résolue dans deux groupes spatiaux différents, P21 et P1, les deux ayant deux dimères protéiques dans l’unité asymétrique. En conformation fermée, le GTP était lié à une fente entre les sous-unités dimères et adjacente à l’épingle à cheveux β. La fente adjacente et perpendiculaire au résidu W330 a réduit l’accessibilité du tryptophane au solvant. La carte de densité électronique du complexe binaire a montré que la guanine (G) était fortement ancrée au NCDT, et les fractions phosphate étaient plus flexibles. Notamment, d’autres oxynucléotides, tels que l’uridine triphosphate (UTP), l’adénosine triphosphate (ATP), la cytidine triphosphate (CTP), etc., n’ont pas co-cristallisé avec NCDT.
Le résidu W301 AA partiellement caché dans le noyau de la protéine a montré un pic de fluorescence. Son émission de fluorescence maximale s’est produite à ~ 340 nm et a diminué parallèlement à l’augmentation de la concentration d’acrylamide, confirmant que la fluorescence du tryptophane était éteignable. Les résultats ont montré que seul GTP affectait l’accessibilité de W330, contrairement à ATP ou UTP. De plus, le NCDT a présenté une trajectoire sigmoïdale avec les changements de température tandis que le mutant est resté inchangé.
AlorsCDT et son mutant avait un Kré valeur de 196 μM et 858 μM, respectivement, en présence de GTP. Ces valeurs indiquaient l’affinité d’un nucléotide d’une molécule GTP qui se lie à l’ARN, et non l’effet synergique de plusieurs interactions nucléotidiques. Des études phylogénétiques ont mis en évidence la conservation de SL5a-c à travers les alpha et bêta-coronavirus, y compris le SRAS-CoV-2. AlorsCDT reconnaissent spécifiquement la séquence apicale SL5a du SRAS-CoV-2, soutenant l’idée que ce domaine protéique pourrait être cette région de la protéine N qui reconnaît les caractéristiques spécifiques de l’ARNg du coronavirus.
En outre, les auteurs ont identifié quinze résidus invariants dans le SARS-CoV-2 NCDT parmi les coronavirus humains. Trois de ces résidus, R259, R262 et F274, appartenaient à la poche de liaison GTP et R259 et R262 étaient responsables de multiples contacts de liaison hydrogène avec les β- et γ-phosphates. Étant donné que cette poche de liaison au GTP reste conservée dans le SRAS-CoV-1, le SRAS-CoV-2, le syndrome respiratoire du Moyen-Orient (MERS) et le NL63, il est possible d’utiliser la poche de liaison au GTP comme cible thérapeutique. En fait, il est possible de concevoir des composés spécifiques contre le SARS-CoV-2 NCDT.
conclusion
La structure cristalline actuelle et les tests biochimiques ont révélé une interaction spécifique entre le G, un nucléotide enrichi dans les régions PS des alpha et bêta-coronavirus, et le résidu W330 AA. De plus, les SL en épingle à cheveux d’ARN dérivés du SRAS-CoV-2 ont montré une interaction préférentielle du NCDT aux oligonucléotides d’ARN contenant G et la perte de spécificité chez le mutant W330A. Puisque ces NCDT Si les interactions facilitent le processus d’assemblage du SARS-CoV-2, les résultats de l’étude indiquent que la poche de liaison au GTP dans la protéine virale N pourrait aider à concevoir des inhibiteurs d’assemblage du SARS-CoV-2.
