Une étude récente publiée sur Place de la recherche* Le serveur de pré-impression a étudié les interactions entre les protéines du coronavirus 2 du syndrome respiratoire aigu sévère (SRAS-CoV-2) et l’acide ribonucléique (ARN) viral et hôte dans les cellules infectées par le virus.
Diverses études ont signalé les préférences des protéines du SRAS-CoV-2 envers des génomes d’ARN viral spécifiques, ce qui entraîne leurs fonctions partagées et séparées dans la transcription, la réplication et l’emballage viral. Cependant, des recherches approfondies sont nécessaires pour comprendre l’impact des interactions ARN-protéine virale sur la suppression de l’expression du gène hôte et son utilisation comme cible thérapeutique potentielle pour la maladie à coronavirus 2019 (COVID-19).
Sommaire
À propos de l’étude
La présente étude a examiné la nature des interactions entre les protéines du SRAS-CoV-2 et le génome viral ainsi que le transcriptome de l’hôte et leur impact sur l’infection virale et l’expression exogène.
L’équipe a collecté BEAS-2B, des cellules rénales embryonnaires humaines 293 (HEK293T), des cellules Vero E6 et une lignée cellulaire A549 surexprimant l’enzyme de conversion de l’angiotensine 2 (A549-ACE2) pour l’étude. Les lignées cellulaires BEAS-2B ont été utilisées pour préparer des cellules pour une réticulation et une immunoprécipitation améliorées (eCLIP). En outre, des plasmides marqués avec des protéines SARS-CoV-2 ont été exprimés dans les lignées cellulaires BEAS-2B. De plus, l’équipe a généré un organoïde pulmonaire humain pour l’étude.
Dans des conditions de niveau de biosécurité (BSL)-3, isolats SARS-CoV-2 USA-WA1/2020, coronavirus humain (HCoV)-19/USA/CA_UCSD_5574/2020 (B.1.1.7) et hCoV-19/Afrique du Sud /KRISP646 K005325/2020 (B.1.351) ont été propagés. Ces unités infectieuses ont ensuite été quantifiées à l’aide d’un test de focalisation fluorescente sur des cellules transmembranaires protéase, sérine 2 (TMPRSS2)-Vero E6. Des essais de coloration par immunofluorescence ont également été effectués sur les cellules A549-ACE2.
L’équipe a également effectué eCLIP sur des cellules Vero E6 infectées par le SRAS-CoV-2 et l’enrichissement eCLIP pour chaque position de nucléotide. Les lectures de ces cellules Vero infectées ont ensuite été cartographiées sur les assemblages génomiques du singe vert d’Afrique et du SARS-CoV-2. En outre, les cellules A549-ACE2 ont été infectées par le SRAS-CoV-2 et purifiées pour préparer des bibliothèques de séquençage d’ARN. Cela a été suivi par le fractionnement des polysomes qui impliquait la génération de lysats cellulaires qui ont été soumis à une extraction d’ARN.
La réticulation et la purification en phase solide (CLASP) ont été réalisées sur les cellules HEK293T. La capture d’interactome d’ARN (RIC) a été exécutée pour permettre l’élusion des protéines SARS-CoV-2. Des techniques telles que le Western blot, l’immunofluorescence, le dosage immuno-enzymatique (ELISA) et le fractionnement subcellulaire ont été utilisées dans l’analyse.
Résultats
Les résultats de l’étude ont montré une couverture de plus de 96 % de tous les échantillons de protéines d’entrée et immunoprécipités (IP) cartographiés au sens positif de l’ARN, indiquant qu’une majorité d’ARN viral interagissait avec les protéines de liaison à l’ARN. Entre les densités de lecture de la protéine non structurale 9 (NSP8) et de l’eCLIP NSP12, un fort enrichissement positionnel relatif a été observé à la position 1 de l’extrémité 5′ avec une augmentation de 573 et 103 fois, respectivement, tandis qu’une amélioration plus faible de 0,75 fois a été observée. observé pour N.
La position au début du site régulateur de la transcription leader (TRS) a également montré un enrichissement positionnel relatif élevé de plus de 4,9 fois pour NSP8 et de plus de 22 fois pour NSP12 avec une augmentation de plus de 0,6 fois pour la nucléocapside SARS-CoV-2 (N) protéine.
Un fort enrichissement des NSP8 et NSP12 a été observé à l’extrémité 3 ‘après le codon stop dans la protéine N jusqu’au début de la région structurée du motif de type tige-boucle II (S2M). L’enrichissement des NSP8 et NSP12 s’est poursuivi après la région S2M, suggérant que la fonction du S2M n’est pas liée aux protéines NSP8 et NSP12. Dans l’ensemble, eCLIP a montré les interactions directes entre NSP8 et NSP12 et les régions non traduites (UTR) qui sont responsables de la régulation de la transcription et de la réplication.
Seule une petite proportion des échantillons d’entrée et IP ont été cartographiés au sens négatif du brin. Cependant, les échantillons IP NSP8 et NSP12 ont enrichi les lectures de sens négatives de 100 et 10 fois par rapport aux échantillons IN. La couverture des échantillons IP dans le brin négatif était de 33 % dans N, ce qui était inférieur à la couverture de 58 % et 80 % dans le NSP8 et le NSP12, respectivement.
Au total, les résultats mettent en évidence la fonction des NSP8 et NSP12 dans la transcription des matrices d’ARN de sens négatif pour la génération d’ARNm (ARN messager) ainsi que la fonction de la protéine N dans la liaison sélective à l’ARN de sens positif.
L’étude a révélé que les gènes N, NSP8 et NSP12 interagissaient avec près de 24, 457 et 703 gènes avec 39, 658 et 1457 pics significatifs qui respectaient le seuil du taux de découverte non reproductible (IDR). En outre, les échantillons IP des protéines NSP8 et NSP12 ont été mappés plus souvent sur le transcrit de l’hôte que sur l’ARN viral. De plus, le séquençage des cellules Vero infectées par le SRAS-CoV-2 a montré que les niveaux cibles d’ARNm des protéines NSP8 et NSP12 étaient plus élevés que ceux des gènes non cibles.
Conclusion
Les résultats de l’étude ont montré que les protéines NSP12 régulaient à la hausse les processus liés à la protéine SARS-CoV-2 N. Les chercheurs ont proposé que NSP9 puisse inhiber l’expression du gène de l’hôte en bloquant l’exportation de l’ARNm. Ce type de compréhension approfondie des interactions ARN protéine-hôte viral peut aider à développer de nouvelles stratégies antivirales pour le traitement du COVID-19.
*Avis important
Research Square publie des rapports scientifiques préliminaires qui ne sont pas évalués par des pairs et, par conséquent, ne doivent pas être considérés comme concluants, guider la pratique clinique/les comportements liés à la santé, ou traités comme des informations établies.
