Dans une récente étude publiée sur bioRxiv* serveur de préimpression, les chercheurs ont réalisé dSTORM (microscopie de reconstruction optique stochastique directe) avec plusieurs techniques de marquage pour visualiser et quantifier l’expression du récepteur de l’enzyme de conversion de l’angiotensine 2 (ACE2) sur diverses cellules.
Sommaire
Fond
Des études ont rapporté que les récepteurs ACE2 sont essentiels à l’entrée du SARS-CoV-2 (coronavirus du syndrome respiratoire aigu sévère 2) dans les cellules hôtes, et les glycoprotéines SARS-CoV-2 S (spike) ont démontré des interactions de liaison avec les membranes plasmiques des cellules hôtes présentant une augmentation Expression ACE2. Cependant, les données sur l’impact de l’expression et de l’organisation des récepteurs ACE2 dans les membranes plasmiques de l’infectivité du SRAS-CoV-2 sont limitées.
À propos de l’étude
Dans la présente étude, les chercheurs ont visualisé les récepteurs ACE2, étudié leurs états oligomères et quantifié l’expression endogène de l’ACE2 dans les membranes plasmiques cellulaires des cellules Vero, des cellules Vero E6, des cellules U2-OS, des cellules COS-7, HEK293T (rein embryonnaire humain 293 cellules) , et les cellules ACE2 surexprimant-HEK293T par imagerie de fluorescence à haute résolution au niveau moléculaire.
Les cellules Vero, les cellules Vero E6 et les cellules HEK293T ont été utilisées comme référence dans les expériences de culture cellulaire, et les cellules HEK293T surexprimant ACE2 ont été utilisées pour évaluer l’impact de l’expression élevée du récepteur ACE2 sur l’efficacité de l’infection cellulaire de l’hôte par le SRAS-CoV- 2. Les cellules U2-OS et les cellules COS-7 ont été utilisées comme témoins car elles auraient une efficacité minimale d’infection par le SRAS-CoV-2 en raison des faibles niveaux d’ACE2.
Une analyse TIRF (fluorescence par réflexion interne totale) et une analyse dSTORM ont été effectuées pour visualiser et quantifier les récepteurs ACE2 dans les membranes plasmiques, respectivement. Pour l’évaluation de la liaison SARS-CoV-2 S-ACE2, l’anticorps monoclonal du clone A20069I avec une activité anti-ACE2 connue a été sélectionné. L’équipe a vérifié l’impact de l’expression endogène de l’ACE2 dans les membranes plasmiques sur l’infectivité du SRAS-CoV-2 à l’aide de particules VSV (virus de la stomatite vésiculeuse) défectueuses en prolifération codant pour les protéines de pointe du coronavirus.
La capacité de l’analyse dSTORM à faire la distinction entre le monomère endogène et les formes dimères des protéines ACE2 de la membrane plasmique a été étudiée par imagerie du cluster monomère de différenciation (CD18), du CD69 homodimère et du CD11a/CD18 hétérodimère à l’aide de cellules Jurkat et d’AF647 prime. -anticorps marqués pour l’immunomarquage cellulaire.
Résultats
L’expression endogène du récepteur ACE2 a été observée sous forme monomérique dans les membranes plasmiques cellulaires avec un à deux récepteurs par µm2. De plus, la liaison aux protéines de pointe trimériques n’a pas induit de regroupement des récepteurs ACE2 dans les membranes plasmiques cellulaires. Les résultats ont été étayés par des analyses d’efficacité d’infection réalisées à l’aide de particules VSV codant pour des protéines de pointe CoV.
L’analyse dSTORM a montré une distribution homogène de l’ACE2 dans les membranes plasmiques des cellules Vero, des cellules Vero E6, des cellules HEK293T et des cellules HEK293T qui surexprimaient l’ACE2. Chaque grappe d’ACE2 avec une moyenne de neuf localisations correspondait à l’expression du récepteur ACE2 marqué. Dans les cellules Vero et les cellules Vero E6, une quantité comparable de récepteurs de l’enzyme de conversion de l’angiotensine 2 a été observée (1,4 récepteurs ACE2 et 2,0 récepteurs ACE2 par µm2, respectivement). L’expression du récepteur ACE2 était légèrement inférieure parmi les cellules 293T de rein embryonnaire humain ayant un récepteur ACE2 par µm-2alors que la surexpression d’ACE2-HEK293T a montré 17,0 récepteurs ACE2 par µm2.
Les résultats se sont traduits par des distances moyennes entre les récepteurs ACE2 parmi les membranes plasmiques de 500,0 nm. Les niveaux de récepteurs ACE2 sont comparables entre les cellules Vero et les cellules Vero E6 ; cependant, l’infection par le VSV n’a été observée que parmi les cellules Vero E6 et l’expression de la protéine fluorescente verte (GFP) parmi les cellules Vero E6 était de 6 %.
Fait intéressant, l’efficacité de l’infection des cellules hôtes par le SRAS-CoV-2 parmi les cellules Vero E6 était cinq fois supérieure à celle observée parmi les cellules HEK293T, bien que les niveaux d’expression du récepteur ACE2 diffèrent légèrement. Les cellules HEK293T surexprimant ACE2 ont présenté la plus grande efficacité d’infection par le SRAS-CoV-2 (28,0 %) concordant avec l’expression élevée du récepteur ACE2.
Les résultats ont indiqué que l’expression du récepteur de l’enzyme de conversion de l’angiotensine 2 parmi les membranes plasmiques des cellules hôtes est essentielle pour l’entrée du SRAS-CoV-2 dans l’hôte, et l’efficacité de l’infection cellulaire de l’hôte par l’infection par le SRAS-CoV-2 est proportionnelle à le nombre de récepteurs ACE2 dans les membranes plasmiques des cellules. Cependant, l’efficacité pourrait fortement différer entre les différentes cellules, indiquant que divers facteurs contribuent à l’efficacité des infections par le SRAS-CoV-2.
Les nombres moyens de localisation du récepteur ACE2 dans chaque groupe étaient de 7,0, 14 et 16 pour la forme monomère de CD18, la forme dimère de CD69 et la forme hétéro-dimère de CD11a/CD18, respectivement. L’analyse dSTORM effectuée à l’aide d’anticorps anti-récepteur anti-ACE2 marqués par AF647 a démontré des résultats identiques, tels qu’obtenus pour CD18, et l’analyse dSTORM utilisant des anticorps anti-neuropiline-1 a vérifié la présence de dimères de récepteurs de neuropiline-1 parmi les cellules HEK293T. Pris ensemble, les résultats de l’analyse de la localisation de l’ACE2 ont indiqué que le traitement avec la forme trimère de la protéine S n’induisait pas la formation d’ACE2 multimérique.
Conclusion
Dans l’ensemble, les résultats de l’étude ont montré qu’une seule interaction de protéine de pointe par particule de SRAS-CoV-2 avec les formes monomères des récepteurs ACE2 est adéquate pour une infection efficace des cellules hôtes par le SRAS-CoV-2. L’ACE2 endogène était présent sous forme monomérique dans les membranes plasmiques, quelle que soit la présence de protéines de pointe, et n’a pas montré de formation de dimères ni de formation d’agrégats plus importants.
De plus, les résultats ont indiqué que l’efficacité des infections par le SRAS-CoV-2 pouvait être déterminée par divers facteurs, y compris le composant lipidique sur les membranes plasmiques et probablement d’autres types de molécules impliquées dans les interactions de liaison entre la protéine de pointe et le récepteur ACE2.
*Avis important
bioRxiv publie des rapports scientifiques préliminaires qui ne sont pas évalués par des pairs et, par conséquent, ne doivent pas être considérés comme concluants, guider la pratique clinique/les comportements liés à la santé, ou traités comme des informations établies.
