Une étude préliminaire réalisée par des chercheurs du Garvan Institute of Medical Research et de l'Université de New South Wales et publiée sur le serveur de préimpression bioRxiv * en juin 2020 signale l'utilisation de la conception chimérique pour produire des normes de référence pour les tests de diagnostic. Cela pourrait permettre une approche très flexible du développement de différentes caractéristiques génétiques dans le même test, même pour des organismes qui ne sont pas directement liés.
Sommaire
L'utilisation de la synthèse d'ADN dans le diagnostic COVID-19
Avec la pandémie continue de COVID-19, les mesures diagnostiques et thérapeutiques sont toujours en cours de développement intensif. Concernant les tests de diagnostic basés sur la détection et la quantification de l'ARN ou de l'ADN viral, les standards de référence sont indispensables. La synthèse d'ADN est une nouvelle technologie utilisée pour créer des molécules synthétiques qui servent de cible aux méthodes de détection génétique.
Ces molécules peuvent être utilisées pour produire rapidement un grand nombre d'étalons de référence, et peuvent même incorporer des séquences d'autres organismes pour répondre aux besoins d'un essai particulier. L'étude actuelle utilise cette méthode pour créer des séquences de référence artificielles qui contenaient les amorces pour tous les tests du coronavirus du syndrome respiratoire aigu sévère 2 (SARS-CoV-2) actuellement publiés par l'Organisation mondiale de la santé.
Ces références synthétiques peuvent être utilisées comme témoins positifs, leur réaction montrant la sensibilité du test moléculaire en cours d'évaluation. En revanche, des contrôles négatifs dépourvus des séquences cibles doivent également être utilisés pour identifier la spécificité du test.
Les problèmes avec les constructions naturelles
Toute référence doit d'abord être validée et démontrée appropriée aux fins du test. Avec les séquences d'ARN, les constructions de contrôle sont destinées à se décomposer au fil du temps, et une contamination est également possible, les deux pouvant conduire à des résultats de test confus. La possibilité d'échec pourrait être de la part du test, du contrôle ou de la méthode utilisée. De tels échecs entraînent des retards de diagnostic, des erreurs de diagnostic et la non-acceptation de résultats de test valides.
Constructions chimériques synthétiques
Pour cette raison, les normes d'ARN et d'ADN sont maintenant synthétisées in vitro, pour rendre le processus de conception plus flexible et ainsi offrir des contrôles sur mesure qui correspondent au test de diagnostic et aux cibles. Le présent article fait état d'une nouvelle stratégie de conception d'étalons de référence qui utilisent des étalons chimériques synthétiques adaptés les uns aux autres pour répondre aux normes d'une méthodologie d'essai appelée essai A / B.
Les séquences cibles d'un test moléculaire sont d'abord obtenues et divisées en deux groupes A et B. Ils sont ensuite joints bout à bout pour obtenir une seule séquence chimérique. L'avantage de répartir également les séquences cibles entre les deux groupes est que chaque cible a son contrôle positif dans un groupe et son contrôle négatif dans l'autre groupe, les positifs et les négatifs étant libres d'être dans l'un ou l'autre groupe.
Ce type de partitionnement égal permet aux contrôles de se valider mutuellement, ce qui rend les résultats du test plus fiables et permet de distinguer l'échec d'un contrôle d'un test ayant échoué ou réussi. Ainsi, les régions cibles d'un seul organisme peuvent être testées ensemble, même si elles sont assez différentes. Il en va de même pour les régions cibles de différents organismes.
L'approche actuelle: paires chimériques pour la validation
En utilisant cette approche, les chercheurs ont utilisé une paire de normes A / B chimériques pour effectuer les tests de diagnostic RT-PCR pour le SRAS-CoV-2, selon les tests en temps réel recommandés par l'Organisation mondiale de la santé (OMS). Les deux normes avaient des régions du génome viral qui sont reconnues par des paires d'amorces publiées et sont compatibles avec des tests de diagnostic déjà autorisés et approuvés.
L'étude actuelle a examiné les performances de ces contrôles par rapport à d'autres séquences de référence et échantillons cliniques, montrant comment ces constructions synthétiques peuvent être utilisées pour valider à la fois la RT-PCR et montrant également comment elles peuvent être utilisées dans d'autres tests.
La première étape consistait à obtenir les séquences du génome viral pour l'isolat initial et toutes les séquences d'amorces publiées par l'OMS pour six pays, 3 en Asie, 2 en Europe et aux États-Unis. Chaque test désormais disponible utilise deux ou trois paires d'amorces, dirigées contre différentes parties de la séquence génomique. Celles-ci ont été alignées sur l'ensemble du génome afin d'identifier les emplacements des séquences amplifiées. Ces amplicons ont été récupérés avec 30 nucléotides appartenant à chaque extrémité.
Cette conception permet l'utilisation des normes chimériques dans chaque pays séparément comme contrôles de test, ainsi qu'une norme commune pour permettre la comparaison directe des résultats et de l'efficacité des tests dans différents ensembles d'amorces et de sondes et de pays.
Ces séquences récupérées ont ensuite été divisées en deux groupes de contrôle, à savoir les normes A / B chimériques. Les régions cibles par pays ont été réparties en deux groupes différents chacune, après quoi les régions ont été assemblées en tandem. Le standard chimérique B contenait également une séquence du gène de l'ARNase P (RP) humain, utilisé comme contrôle humain positif.
De même, les normes contenaient une séquence de contrôle unique pour aider à la détection de chacune d'entre elles, si nécessaire. Chacun avait une région promotrice initiale afin qu'il puisse être transcrit in vitro, avec une queue poly-A terminale et un site de restriction, pour permettre la linéarisation du vecteur.
Les deux séquences standard A / B différentes ont ensuite été synthétisées. Le produit a été cloné dans des plasmides, qui ont ensuite été linéarisés et transcrits in vitro. Le produit final était les étalons d'ARN synthétique, après purification et validation.
Ils ont ensuite utilisé d'autres contrôles de référence pour valider les normes chimériques et les ont testés contre les génomes de 12 patients COVID-19, qui avaient déjà été séquencés indépendamment. Comme prévu, la RT-PCR a diagnostiqué à la fois des étalons chimériques et des échantillons de patients, les gènes cibles N1, N2 et N3 étant amplifiés dans l'ARN du patient et l'ADNc du patient.
Les chercheurs ont découvert que les deux normes pouvaient être détectées jusqu'à 10 heures-4 dilution ou une limite de détection pour un nombre de copies de 0,39 et 0,42 copies / μl pour les étalons A et B, respectivement.
Conception de contrôles chimériques pour SARS-CoV-2. (a) Vue du navigateur du génome du génome du SARS-CoV-2 (vert) montrant les sites de liaison des amorces RT-PCR publiés en temps réel par l'OMS (rouge). Les amplicons attendus pour le test CDC sont affichés en gris plus foncé. Les autres régions ciblées ont été exclusivement réparties entre les normes chimériques A / B. (b) Les différentes régions ciblées pour les normes A et B ont été mélangées et réunies pour former des séquences chimériques. La conception par paires de normes A / B chimériques, où une cible dans A est absente dans B (et vice versa), permet aux transcrits d'ARN synthétiques d'agir simultanément comme contrôles positifs et négatifs pour les ensembles d'amorces / sondes RT-PCR en temps réel . cela permet une validation croisée interne des contrôles positifs et négatifs entre les normes A et B. Le squelette du vecteur a été omis de la représentation des normes chimériques A / B.
Applications futures
Les applications de cette technologie incluent non seulement une nouvelle technologie de diagnostic, mais également des tests pour de multiples caractéristiques génétiques comme des mutations et des séquences virales, des mutations cancéreuses et des signatures de gènes. Deuxièmement, lorsque la pandémie actuelle commencera à décliner, de tels contrôles seront nécessaires pour un diagnostic précis et rapide de l'infection.
L'étude résume: «L'approche chimérique A / B fournit un nouveau modèle pour le développement de normes de référence rentables qui permettent de contrôler de multiples variables expérimentales basées sur des conceptions simples mais complètes.
*Avis important
bioRxiv publie des rapports scientifiques préliminaires qui ne sont pas évalués par des pairs et, par conséquent, ne doivent pas être considérés comme concluants, orienter la pratique clinique / les comportements liés à la santé, ou traités comme des informations établies.
