Dans une étude récente publiée dans Pathogènes PLoSles chercheurs ont décrit un nouveau mécanisme d’action antiviral pour une thiopurine approuvée par la FDA (administration des aliments et des médicaments) connue sous le nom de 6-thioguanine (6-TG).
Sommaire
Arrière plan
La pandémie de coronavirus 2 (SRAS-CoV-2) du syndrome respiratoire aigu sévère a stimulé les efforts pour réutiliser les médicaments afin de développer des antiviraux efficaces et sûrs. Les antiviraux ciblés sur l’hôte (HTA) inhibent indirectement la réplication virale en inhibant les processus cellulaires de l’hôte et/ou en stimulant les réponses antivirales.
Les auteurs de la présente étude ont précédemment démontré que les thiopurines, la 6-thioguanosine (6-TGo) et la 6-TG inhibent la réplication de l’IAV (virus de la grippe A) en activant la réponse protéique dépliée (UPR) et en interférant avec le traitement et l’accumulation de la glycoprotéine virale.
À propos de l’étude
La présente étude a examiné si la 6-TG et d’autres thiopurines pouvaient interférer avec les glycoprotéines du coronavirus (CoV).
L’efficacité de la thiopurine contre le SARS-CoV-2 sévère, l’inhibition de la réplication du CoV humain (HCoV)-OC43 et du HCoV-229E et la perturbation de la synthèse de l’acide ribonucléique (ARN) viral ont été évaluées. Des expériences de culture cellulaire ont été réalisées en utilisant des cellules 293T, HCT-8 (lignée cellulaire d’adénocarcinome iléo-colique humain), Huh7.5 (lignée cellulaire dérivée d’un hépatome humain), fibroblaste immortalisé par la transcriptase inverse de la télomérase humaine primaire (hTERT) et cellules Calu-3 (lignée cellulaire d’adénocarcinome pulmonaire).
En outre, la libération de particules virales a été évaluée par analyse quantitative de la réaction en chaîne par polymérase de transcription inverse (RT-qPCR) des génomes viraux extracellulaires. Une analyse d’immunomarquage utilisant des cellules infectées par HCoV-OC43 a été réalisée pour les anticorps anti-nucléocapside (N) et l’ARN double brin (ARNdb). Des tests de ribopuromycinylation ont été effectués et des cellules 293T ont été transfectées avec des plasmides codant pour les protéines structurelles du SRAS-CoV-2 telles que les protéines N, de pointe (S), de membrane (M) et d’enveloppe (E) pour évaluer l’impact du 6-TG sur le SRAS -Protéines structurelles du CoV-2.
En outre, le SRAS-CoV-2 S a été exprimé de manière ectopique et évalué par rapport à plusieurs concentrations de 6-TG, après quoi une analyse par immunotransfert avec des pseudovirions (PV) a été effectuée. Les lysats de cellules 293T exprimant S ont été traités avec la PNGase F (peptide-N-glycosidase) pour éliminer les glycanes liés à l’azote des chaînes polypeptidiques, et les effets de la 6-TG sur la voie de sécrétion ont été évalués par des dosages de Gaussia luciférase.
Une analyse par cytométrie en flux (FC) et une coloration de surface de cellules 293T exprimant S ont été effectuées pour mesurer la sécrétion de S, et les cellules ont été co-transfectées avec des plasmides EGFP + (protéine fluorescente verte améliorée) pour évaluer les altérations de l’accumulation de protéine S.
De plus, des co-transfections cellulaires avec des protéines structurales et des plasmides du SRAS-CoV-2 ont été réalisées pour élucider les mécanismes d’assemblage défectueux, et l’équipe a déterminé si des cibles 6-TG connues provoquent des défauts de maturation de la protéine S. L’équipe a également évalué les altérations morphologiques potentielles du HCoV après un traitement au 6-TG par analyse par microscopie électronique à transmission (TEM).
Résultats
La 6-TG a inhibé le stade initial de la réplication du SARS-CoV-2 et du HCoV-OC43, limitant le génome viral complet, les protéines structurelles et l’accumulation d’ARN sous-génomique. L’analyse de l’expression ectopique de S a montré une mobilité électrophorétique accrue de la protéine S de plusieurs βCoV par traitement au 6-TG, conformément à la in vitro élimination enzymatique des oligosaccharides N-liés de la protéine S. Les VLP du SRAS-CoV-2 (particules de type virus) dans les cellules traitées au 6-TG manquaient de protéine S.
Des effets 6-TG similaires ont été observés sur la production de lentivirus pseudotypés SARS-CoV-2 S, produisant des pseudovirus déficients en S qui ne pouvaient pas infecter les cellules exprimant l’enzyme de conversion de l’angiotensine 2 (ACE2). Les résultats ont indiqué que le traitement à la 6-TG entraînait un traitement et un trafic défectueux de la protéine S et entravait ainsi l’assemblage du virus de la progéniture infectieuse. Cependant, la conversion de 6-TG en sa forme nucléotidique (nt) par HPRT1 (hypoxanthine phosphoribosyltransférase 1) était essentielle pour l’activité antivirale, qui pourrait être surmontée par ML099, un agoniste de la guanosine-5′-triphosphate (GTP)ase.
Aucun inhibiteur de la GTPase [Ras-related C3 botulinum toxin substrate 1 (Rac1), Ras homolog family member A (RhoA), and Cell division control protein 42 homolog (CDC42)] affectait l’accumulation ou le traitement du S, indiquant que la 6-TG inhibait la maturation du S en inhibant une GTPase cellulaire inconnue. La 6-TG, la 6-thioguanosine (6-TGo) et la 6-mercaptopurine (6-MP) ont provoqué des réductions de quatre log de la libération du virion du SRAS-CoV-2 et la 6-TGo a montré une inhibition comparable du HCoV-OC43 et du HCoV-229E, alors que 6-MP était inefficace. L’analyse RT-qPCR a montré que le traitement par 6-TG réduisait les titres de HCOV-OC43 de 20 fois le premier jour de l’infection.
L’ARN viral génomique putatif de pleine longueur a été réduit de 10 fois à la plupart des stades de l’infection. Le traitement à la 6-TG a entraîné des réductions similaires de l’ARN sous-génomique viral codant pour S et N, corrélées à une accumulation de protéines plus faible. L’immunomarquage des cellules infectées par HCoV-OC43 avec des anticorps anti-N a montré une coloration ponctuée initialement et une coloration périphérique par la suite. Après le traitement au 6-TG, les zones colorées étaient plus lumineuses, avec de grands points lacrymaux observés après 24 heures après l’infection (hpi). L’immunomarquage pour l’ARNdb a montré des signaux d’ARNdb considérablement réduits parmi les cellules traitées au 6-TG.
La 6-TG a retardé ou supprimé les réponses transcriptionnelles en aval de l’UPR, mais n’a pas affecté les taux d’initiation de la traduction dans les cellules infectées par HCoV-OC43. L’inhibition par les 6-TG de l’infection par HCoV-OC43 a limité l’activation de l’enzyme nécessitant l’inositol 1 (IRE1) et l’accumulation du gène cible de la protéine de liaison X-box 1 (XBP1s). Les résultats ont indiqué que même si la 6-TG interférait avec la synthèse d’ARN génomique et sous-génomique viral de pleine longueur, l’arrêt de l’hôte n’était pas perturbé.
Le 6-TG a réduit l’expression de la protéine structurale du SRAS-CoV-2 (en particulier S) et l’analyse par immunotransfert a montré une bande S de poids moléculaire élevé dénotant la protéine précurseur S0, qui était également sensible au traitement PNGaseF. Les résultats de l’analyse de la mobilité électrophorétique ont indiqué que la 6-TG inhibait la glycosylation et le traitement du S, et les expériences sur la luciférase de Gaussia ont montré que la 6-TG ne provoquait pas de perturbation globale des voies de sécrétion. L’analyse TEM a montré moins de particules virales dans les cellules traitées au 6-TG.
Conclusion
Dans l’ensemble, les résultats de l’étude ont mis en évidence de petites GTPases comme cibles potentielles d’HTA, et les effets de la 6-TG sur S dans plusieurs modèles, tels que l’expression ectopique, les infections HCoV authentiques et la production de PV et de VLP, indiquent un mécanisme antiviral au-delà de la papaïne. inhibition de la protéase (PLpro).
