*Avis important: bioRxiv publie des rapports scientifiques préliminaires qui ne sont pas évalués par des pairs et, par conséquent, ne doivent pas être considérés comme concluants, guider la pratique clinique/le comportement lié à la santé, ni être traités comme des informations établies.
Dans une étude récente publiée sur le bioRxiv serveur de prépublication*, une équipe internationale de chercheurs a étudié les interactions entre la protéine non structurelle 3 (NSP3) du coronavirus 2 du syndrome respiratoire aigu sévère (SRAS-CoV-2) et les protéines de retard mental X fragile (FMRP) et a exploré leur contribution à la maladie à coronavirus 2019 (COVID-19) physiopathologie.
Les granules de stress, de grands assemblages protéine-acide ribonucléique (ARN), sont essentiels à la réplication des virus dans les cellules hôtes. Les granules, composés de molécules de protéines de liaison à l’acide ribonucléique telles que les protéines de liaison au domaine SH3 activant la Ras-GTPase 1 et 2 (G3BP1/2) et la protéine associée à l’ubiquitine 2 (UBAP2L), sont essentielles à la signalisation antivirale. Le syndrome du X fragile, une forme génétique de retard mental, est lié à une expression dérégulée de ces protéines. Cependant, la base moléculaire exacte du syndrome du X fragile reste inconnue et les interactions entre virus et cellules hôtes sont cruciales pour la réplication virale.
À propos de l’étude
La présente étude a vérifié l’interaction non structurale de la protéine 3-FMRP du SRAS-CoV-2 et son rôle dans le COVID-19.
Utilisant la protéine non structurale 3 du SRAS-CoV-2, les chercheurs ont exploré les liens entre le SRAS-CoV-2 et les composants cellulaires de l’hôte. Ils ont effectué une spectrométrie de masse pour comparer le NSP3 marqué avec YFP et contrôler la purification. En outre, des fragments de NSP3 marqués par YFP ont été produits dans des cellules Henrietta Lacks (HeLa), suivis d’une purification immunologique et d’une analyse par transfert Western pour évaluer la liaison à la protéine 1 de retard mental X fragile (FXR1). Ils ont modifié des blocs de 10 acides aminés en Ala dans les zones intrinsèquement désordonnées de NSP3 1-181 pour trouver le site de liaison FMRP.
Au total, neuf mutants ont été créés, dont deux couvraient l’extrémité N-terminale intrinsèquement désordonnée et sept suivaient le domaine Ubl1. Des cellules de singe vert africain (VeroE6) et d’adénocarcinome pulmonaire humain (Calu3) ont été utilisées pour étudier l’effet de l’interaction NSP3-FMRP sur l’infection par le SRAS-CoV-2. Les virus de type sauvage (WT) ont démontré une baisse de 0,50 à 1,30 log du titre du SRAS-CoV-2 après l’activation des gènes stimulés par l’interféron (ISG) par rapport aux virus non traités. Les mutants NSP3, en revanche, étaient deux à trois fois plus sensibles que les mutants WT.
Étudier la contribution des interactions de la protéine non structurale 3-FMRP du SRAS-CoV-2 dans le in vivo Dans ces contextes, les chercheurs ont infecté des hamsters avec la souche de type sauvage du SRAS-CoV-2 et le mutant non structurel de la protéine 3, observant une perte de poids et une maladie sur sept jours. En outre, les chercheurs ont utilisé le multimère AlphaFold pour construire un modèle structurel du complexe et ont évalué si la liaison NSP3 recâblait l’interactome FMRP.
L’équipe a cartographié le site de liaison de UBAP2L aux FMRP et a construit un réseau de peptides englobant la zone UBAP2L avec des peptides 20mer déplacés par deux acides aminés à la fois pour déterminer si les données de l’interactome indiquaient que UBAP2L et NSP3 étaient en compétition pour la liaison à une interface comparable sur les FMRP. . La localisation de FXR1 a été étudiée dans les cellules VeroE6 pour évaluer la capacité de NSP3 à contrecarrer les systèmes antiviraux des cellules hôtes via une influence sur la composition et l’assemblage des granules de stress.
Résultats
L’équipe a découvert un nouveau lien entre la protéine non structurale 3 du SRAS-CoV-2 et FMR1 et FXR1-2. Les mutants SARS-CoV-2 NSP3 qui ont empêché la liaison au FMRP ont ralenti la prolifération in vitro et retarder l’apparition de la maladie chez les animaux. La mutation I304N chez un patient atteint du syndrome du X fragile a altéré la liaison d’un motif peptidique unique dans NSP3 aux deux principaux domaines KH des FMRP. Grâce à une compétition directe avec un motif peptidique dans UBAP2L, la liaison de NSP3 aux FMRP a inhibé leur interaction avec le composant des granules de stress UBAP2L, empêchant ainsi l’intégration de la FMRP dans les granules de stress.
La protéine de liaison à l’ARN FMR1 et les protéines FXR1 et FXR2 étroitement apparentées étaient les facteurs cellulaires de l’hôte les plus remarquables co-purifiants avec NSP3. Les résultats ont caractérisé le motif de liaison de NSP3 aux FMRP et ont montré qu’il était conservé dans la famille des Sarbecovirus. Les mutants viraux étaient affaiblis en prolifération après 24 heures d’infection par rapport à la souche de type sauvage SARS-CoV-2 dans les cellules VeroE6. La capacité diminuée des mutants non structurels de la protéine 3 dans les cellules VeroE6 déficientes en interféron indique que les gènes stimulés par l’IFN (ISG) pourraient ne pas être responsables de l’atténuation.
Par rapport aux animaux témoins WT, les hamsters infectés par les mutants mut1 et mut2 de NPS3 ne présentaient aucune différence significative en termes de perte de poids ou de maladie. De même, l’histopathologie a montré que les hamsters infectés par le mutant NSP3 présentaient beaucoup moins d’infiltrations et de dommages cellulaires que les témoins. La séquence non structurelle de la protéine 3 du SRAS-CoV-2 contenant 20 acides aminés était nécessaire et adéquate pour interagir avec les FMRP. Un peptide 23mer de NSP3, dérivé d’alphavirus, a montré une liaison à la protéine 1 de retard mental X fragile et à FXR1-122, indiquant que les virus détournent les protéines de retard mental X fragiles par une méthode différente. L’équipe a identifié trois résidus NSP3 essentiels à la liaison à la FMRP, à savoir F145A, G140 et Y138.
Le peptide non structurel de la protéine 3 a interagi avec le motif GxxG du domaine FMRP KH2 de la même manière qu’il a été démontré que l’ARN et l’acide désoxyribonucléique se lient aux domaines KH. En présence du peptide NSP3 WT, l’équipe a constaté un changement spectaculaire des constituants des granules de stress par rapport à FXR1. UBAP2L a présenté une diminution significative de la purification simultanée, ce qui est cohérent avec un précédent criblage à deux hybrides révélant des interactions directes probables entre FXR1 215 à 360 et UBAP2L. Le complexe TOP3B-TDRD3-FMRP s’est avéré déplacé, ce qui correspond à l’incapacité du mutant génétique fragile X de retard mental 1 I304N à se lier à NSP3.
Le mutant ne s’est pas lié aux constituants des granules de stress ni à UBAP2L dans les cellules. Le mécanisme d’interaction FMRP a été conservé entre UBAP2 et UBAP2L, et les peptides NSP3 et UBAP2L étaient en compétition pour la calorimétrie par titrage isotherme (ITC) se liant à FXR1 260-315. Cela a inhibé l’interaction UBAP2L-FMRP, nécessaire à la fixation de la FMRP avec les granules de stress, et a antagonisé efficacement les mécanismes de défense antiviraux au cours des premiers stades de l’infection.
Dans l’ensemble, les résultats de l’étude ont fourni des informations uniques sur la manière dont le SRAS-CoV-2 détourne les protéines des cellules hôtes pour une infection efficace, ainsi que des explications moléculaires pour les déficiences génétiques sous-jacentes potentielles dans le syndrome de l’X fragile.
*Avis important: bioRxiv publie des rapports scientifiques préliminaires qui ne sont pas évalués par des pairs et, par conséquent, ne doivent pas être considérés comme concluants, guider la pratique clinique/le comportement lié à la santé, ni être traités comme des informations établies.
