Les oligonucléotides antisens (ASO) sont des molécules d’ADN simple brin synthétiques qui s’hybrident avec des cibles d’ARNm pour les dégrader ou empêcher leur traduction par la machinerie cellulaire. Les ASO ont été étudiés pour une utilisation contre les infections virales pendant plusieurs décennies, avec seulement un petit nombre d’entre eux voyant une utilisation clinique ; la plupart ont été destinés à traiter des troubles génétiques.
In situ L’ARN est souvent replié dans des structures qui empêchent les ASO de s’hybrider, ce qui limite quelque peu leur efficacité. Ainsi, les stratégies thérapeutiques ASO ciblent souvent des régions d’ARN connues pour ne pas se replier ou utiliser autrement des structures tridimensionnelles qui arrangent les brins dans une conformation stable.
Dans un article récemment téléchargé sur le bioRxiv* serveur de préimpression, les ASO basés sur la structure sont développés contre le SARS-CoV-2, destinés à se lier à l’ARN dans sa structure in situ forme, plutôt que la section linéaire plus rarement rencontrée, obtenant une plus grande affinité et spécificité que les ASO linéaires, et démontrant l’inhibition de la réplication du virus dans les cellules humaines.
Le SRAS-CoV-2 est un grand virus à ARN simple brin avec plusieurs sites hautement conservés et fonctionnellement essentiels sur le génome qui constitueraient des cibles médicamenteuses appropriées. L’extrémité 5′ du génome est dominée par le gène de réplicase qui contient deux cadres de lecture ouverts, ORF1a et 1b, qui se chevauchent au niveau de l’élément de stimulation de décalage de cadre (FSE), requis pour la traduction d’ORF1b.
Les séquences régulatrices de la transcription (TRS) sont également essentielles à l’expression des gènes liés à la réplication et à la propagation du virus, et les oligonucléotides antisens ciblant les régions TRS et FSE ont déjà réussi à inhiber le SARS-CoV-1.
Identifier les cibles du génome du SRAS-CoV-2
Pour identifier d’abord les structures d’ARN appropriées, le groupe a examiné les structures en épingle à cheveux et pseudo-nœuds d’ARN qui ressemblent à l’hybridation ASO en termes de compatibilité de séquence. Ils ont identifié 93 structures au sein du génome du SRAS-CoV-2 qui s’engagent dans des interactions tertiaires étendues avec l’ARN environnant. Plusieurs ont été sélectionnés pour un examen plus approfondi, et des épingles à cheveux ASO ont été conçues pour interagir avec elles de manière optimale, avec une affinité testée par calorimétrie de titrage isotherme.
Le groupe a généré des oligonucléotides tridimensionnels qui ciblent ces régions dans leur in situ conformation. Plutôt que de s’appuyer sur l’appariement base-base uniquement entre l’ASO et l’ARN, cette méthode garantit un degré élevé d’interactions tertiaires telles que la liaison hydrogène entre les brins. Le groupe souligne l’importance de la formation d’une paire de Hoogsteen entre l’ASO et la cible d’ARN sélectionnée à l’extrémité 3′ de la boucle en épingle à cheveux, où une base est inversée par rapport à l’arrangement de liaison normal, garantissant une géométrie appropriée et améliorant l’affinité.
Trois résidus U en surplomb sur l’ASO se sont avérés essentiels à la liaison de haute affinité, car l’élimination a réduit le taux de liaison de 20 fois. De même, la substitution des résidus A aux positions 36 et 37 sur l’ASO pour les résidus C a réduit l’affinité de liaison de 130 fois, indiquant que les triples de bases à sillon majeur et à sillon mineur sont également essentiels à la liaison de haute affinité.
Tester les oligonucléotides antisens
FSE contient une structure de pseudo-nœud qui, pendant la traduction, fait reculer le ribosome d’une paire de bases et perturbe le pseudo-nœud, permettant à la traduction de se poursuivre. Sans ce processus, le ribosome rencontre un codon stop et cesse sa traduction prématurément. Le groupe a conçu un ASO 3D destiné à se lier avec FSE et à empêcher ce processus de se produire, où un ASO de 22 nucléotides de long est fait pour s’hybrider avec le pseudo-nœud et générer une paire Hoogsteen et trois triplets de base.
Un deuxième ASO 3D ciblant TRS a également été généré. Dans ce cas, en utilisant 14 nucléotides qui se lient à la région 5′ de la boucle, laissant neuf résidus 3′ libres pour se reconnecter à la tige en épingle à cheveux et former des triples de base et une paire de Hoogsteen.
Les cellules HEK293 exprimant le récepteur ACE2 humain ont d’abord été transfectées avec les ASO générés ou leur forme linéaire et infectées par le SARS-CoV-2 le lendemain, où les charges virales ont ensuite été évaluées 24 heures après l’infection. Les ASO linéaires contre FSE et TRS ont montré une faible inhibition du SRAS-CoV-2, comparable aux cellules témoins sans ASO ajoutés, tandis que les structures ASO tridimensionnelles générées par le groupe ont démontré une forte inhibition à des concentrations de 10 et 20 M. Contre l’épingle à cheveux TRS, une concentration inhibitrice (50 %) de 0,7 µM a été atteinte, contre 2,7 µM d’ASO 3D contre le pseudo-nœud FSE. Fait intéressant, cependant, le premier plafonnait à 86% d’inhibition tandis que le dernier pouvait complètement inhiber la réplication virale.
Des concentrations aussi élevées que 20 M d’ASO contre FSE se sont avérées réduire la viabilité cellulaire à environ 70 %, ce qui implique une cytotoxicité et a probablement un impact sur l’estimation de l’inhibition du virus. À la recherche de la source de cette cytotoxicité, le groupe a évalué le génome humain pour l’ARNm complémentaire, trouvant que la glucose-6-phosphate isomérase était une bonne correspondance. Le groupe a supprimé deux nucléotides de l’extrémité 5′ de l’ASO, réduisant l’affinité envers la glucose-6-phosphate isomérase, et l’a ensuite démontré dans d’autres tests de viabilité cellulaire qui ont montré une viabilité de 90 % à 20 M, tandis que l’activité de l’ASO envers l’ARN viral, cependant, a été maintenu.
Cette étude démontre que les ASO tridimensionnels sont une amélioration par rapport aux ASO linéaires conventionnels dans l’inhibition virale, un meilleur accès et un meilleur accès aux sites clés du génome du SRAS-CoV-2. Impliquer des interactions tertiaires pour améliorer l’affinité de l’ASO envers une région spécifique de l’ARN viral permet également d’utiliser des ASO plus courts qui pénètrent mieux dans les cellules, ce qui peut également encourager une biodistribution plus favorable et entraîner des coûts de fabrication inférieurs.
*Avis important
bioRxiv publie des rapports scientifiques préliminaires qui ne sont pas évalués par des pairs et, par conséquent, ne doivent pas être considérés comme concluants, orienter la pratique clinique/le comportement lié à la santé, ou traités comme des informations établies.
