Production de six anticorps monoclonaux contre la protéine de pointe du SRAS-CoV-2

Selon certains experts, la pandémie du coronavirus 2 du syndrome respiratoire aigu sévère (SRAS-CoV-2) devrait durer plusieurs années. Cette hypothèse alarmante oblige à des interventions thérapeutiques rapides et réussies pour atténuer cette infection. Dans cet effort, divers anticorps monoclonaux recombinants d'origine humaine qui neutralisent l'infection par le SRAS-CoV-2 ont été isolés chez des patients convalescents. Cependant, le besoin d'anticorps monoclonaux dédiés à la recherche en pathologie moléculaire n'est pas entièrement satisfait; ces anticorps peuvent être utilisés pour disséquer le mécanisme moléculaire du cycle de vie du virus.

Youjia Guo et coll. dans un récent bioRxiv* Le papier préimprimé démontre les performances robustes des anticorps monoclonaux anti-SARS-CoV-2 de souris dans les dosages immunologiques, y compris le transfert Western, l'ELISA, l'immunofluorescence et l'immunoprécipitation ainsi que l'activité neutralisante in vitro contre l'infection par le SRAS-CoV-2. Les anticorps monoclonaux sont produits par un clone de cellules immunitaires contre un épitope de l'antigène. Parce que les anticorps utilisés dans cette étude sont d'origine souris, cela les rend compatibles avec les configurations d'immunoessais expérimentales couramment utilisées dans les laboratoires de recherche de base en biologie moléculaire dans le monde; la technologie conventionnelle d'hybridome de souris garantit également une production à grande échelle et une distribution facile.

Cette technologie fournit une source fiable d'anticorps monoclonaux de souris (Kohler et Milstein, 1975). Les anticorps de souris humanisés et la génération ultérieure d'anticorps entièrement humains par diverses techniques sont largement utilisés pour diverses thérapies. Par exemple, le palivizumab, un anticorps monoclonal de souris humanisé neutralisant le virus respiratoire syncytial (RSV), est utilisé en milieu clinique à titre prophylactique pour protéger les nourrissons vulnérables. Avec cette approche, l'immunisation passive avec un anticorps monoclonal est actuellement considérée comme un traitement du COVID-19.

Bien qu'un grand nombre d'anticorps neutralisants inhibent l'infection par le SRAS-CoV-2, les auteurs affirment qu'il existe encore un manque criant de données sur un anticorps bien caractérisé disponible pour les techniques de recherche de base telles que le transfert de Western, l'immunofluorescence et l'immunoprécipitation. pour étudier le cycle de vie viral. Avec ce besoin à l'esprit, ils établissent six anticorps monoclonaux contre la glycoprotéine de pointe du SRAS-CoV-2 et rapportent l'atténuation de l'interaction virale avec les cellules in vitro. Les résultats observés dans l'étude sont résumés ci-dessous.

Inhibition de l'interaction ACE2-pic par S1D7 et S3D8 A. Un schéma du test de pull-down de pic conçu pour évaluer l'inhibition de la liaison de pic ACE2 par un anticorps monoclonal. La glycoprotéine de pointe dépourvue de domaine TM (SATM) a été mélangée avec un anticorps monoclonal. ACE2-SBP a été appliqué pour capturer SΔTM sur des billes de streptavidine de manière compétitive. Le SΔTM capturé a été détecté par WB comme mesure de la capacité inhibitrice de l'anticorps. S1, S1D7; S3, S3D8; ni, IgG de souris non immunisées. B. WB du test pull-down de pic utilisant l'anticorps R52. En présence des clones S1D7 et S3D8, ACE2 n'a pas pu abaisser SΔTM. C. Schéma d'un test de neutralisation à base de billes conçu pour quantifier l'inhibition de la liaison ACE2-RBD par un anticorps monoclonal. La glycoprotéine RBD-SBP immobilisée sur des billes de streptavidine a été mélangée avec un anticorps monoclonal. ACE2-FLAG a été appliqué pour se lier de manière compétitive avec RBD. La liaison ACE2-RBD a été quantifiée en mesurant le signal donné par un anticorps anti-FLAG conjugué avec du fluorophore APC en utilisant FACS.

Production de six anticorps monoclonaux contre la glycoprotéine de pointe

La glycoprotéine de pointe du SARS-CoV-2 est une protéine de fusion homotrimérique composée de deux sous-unités: S1 et S2. Les chercheurs ont suivi la méthodologie développée par Wrapp et al., 2020 – dans laquelle la protéine de pointe SARS-CoV-2 a été conçue pour former un homotrimère stable résistant à la protéolyse pendant la préparation des protéines. Les souris ont été immunisées avec ces protéines de pointe recombinantes pour générer des anticorps anti-SARS-CoV-2, suivies d'une fusion cellulaire pour générer un anticorps produisant un hybridome. Dans cette étude, après que les surnageants de culture ont été pré-criblés, six hybridomes monoclonaux ont été isolés et évalués.

Les anticorps ont été purifiés à partir du surnageant de culture et caractérisés en détail, avec des performances ELISA et WB.

Les anticorps S1D7 et S3D8 ont montré des performances plus élevées sur IP (immunoprécipitation) et IF (immunofluorescence)

Pour comprendre le mécanisme moléculaire de l'infection par le SRAS-CoV-2, en particulier l'entrée cellulaire, où ces protéines jouent un rôle important, l'anticorps doit reconnaître la structure tertiaire intacte des protéines de pointe. L'activité IP des anticorps peut être corrélée à la capture de la structure native de la protéine cible et à l'utilisation de l'infection. Tous les clones étaient capables d'immunoprécipitation avec les glycoprotéines RBD et ectodomaine (S∆TM) avec une efficacité IP différentielle. Le test d'immunofluorescence reflète la localisation cellulaire des protéines de pointe, qui élucide le mécanisme de conditionnement et la maturation de la variance lors de la libération de la membrane cellulaire.

Inhibition de la liaison ACE2-Spike des anticorps monoclonaux

Les auteurs montrent dans cette étude que l'interaction pic-ACE2 est interceptée par une liaison compétitive entre les anticorps neutralisants et la glycoprotéine pic – inhibant ainsi la liaison pic-ACE2 ou même neutralisant l'infection par le SRAS-CoV-2. Ils ont également quantifié la capacité d'inhibition, en utilisant un test de neutralisation à base de billes en mesurant la quantité d'ACE2 lié aux billes RBD après blocage avec des anticorps monoclonaux.

S1D7 et S3D8 ont montré une activité neutralisante contre le SARS-CoV-2

Ensuite, les chercheurs ont testé la capacité de l'anticorps à inhiber l'infection par le SRAS-CoV-2 dans les cellules VeroE6 / TM2. Ces cellules sont plus sujettes aux infections virales que la lignée cellulaire VeroE6 couramment adoptée. Deux des six anticorps utilisés dans l'étude ont bloqué l'infection par le SRAS-CoV-2 de manière significative avec des valeurs de CI50 de 405,2 ng / mL et 139 ng / mL, respectivement. Lorsque les chercheurs ont mélangé ces deux anticorps, le cocktail a montré une activité neutralisante intermédiaire, suggérant un mécanisme inhibiteur partagé.

Les auteurs déclarent que les anticorps de souris utilisés dans cette étude ne s'appliquent pas au traitement clinique. Cependant, ils peuvent être utilisés pour étudier le mécanisme des réponses immunitaires lors de l'immunisation passive en utilisant des modèles murins pour l'infection par le SRAS-CoV-2. Un examen approfondi des principes fondamentaux de l'attaque de ce virus a des implications importantes pour le développement de contre-mesures, ainsi que pour le diagnostic, la conception de vaccins et la découverte de médicaments.

*Avis important

bioRxiv publie des rapports scientifiques préliminaires qui ne sont pas évalués par des pairs et, par conséquent, ne doivent pas être considérés comme concluants, guider la pratique clinique / les comportements liés à la santé, ou traités comme des informations établies.