La pandémie actuelle de la maladie à coronavirus 2019 (COVID-19) est causée par la circulation mondiale du coronavirus 2 du syndrome respiratoire aigu sévère (SRAS-CoV-2), qui est hautement transmissible et contagieux. Une identification rapide du virus était nécessaire pour la prévention de l’épidémie, ainsi que pour contrôler la propagation du virus.
Étudier: Un biocapteur visuel basé sur un smartphone pour les diagnostics SARS-CoV-2 alimentés par CRISPR-Cas. Crédit d’image : Photos de CI/Shutterstock.com
Fond
La réaction en chaîne par polymérase quantitative en temps réel (qPCR) a été la méthode la plus populaire pour la détection du SARS-CoV-2. À ce jour, cette méthode a été normalisée par l’Organisation mondiale de la santé (OMS) pour le diagnostic du COVID-19.
Récemment, les répétitions palindromiques courtes régulièrement espacées en cluster (CRISPR), ainsi que les gènes associés à CRISPR (Cas), ont démontré un énorme potentiel en biodétection. Certains systèmes CRISPR-Cas tels que Cas13a et Cas12a se sont avérés effectuer des activités de coupe d’acide nucléique non spécifiques lors de la reconnaissance d’une séquence cible. Cette activité est également connue sous le nom d’activité de trans-clivage, qui a conduit à la détection d’acide nucléique avec une sensibilité et une sélectivité élevées.
Des progrès récents ont été réalisés dans la détection du SRAS-CoV-2 à l’aide de CRISPR-Cas13a ou CRISPR-Cas12a, couplés soit à des lectures de signaux fluorescents, soit à des lectures de signaux colorimétriques dans les tests de flux latéral sur papier. Cependant, la sensibilité et la sélectivité de ces méthodes nécessitent une amélioration supplémentaire pour fournir des performances satisfaisantes avec des échantillons cliniques.
De plus, les applications des nanoparticules d’or plasmoniques (AuNPs) dans la biodétection ont gagné en importance ces dernières années. Plusieurs avantages des smartphones, tels que leur interactivité, leur portabilité et leurs appareils photo, se sont également révélés importants dans la biodétection. Le couplage des smartphones avec la biodétection fournit un dispositif analytique déployable sur le terrain et convivial.
Une nouvelle étude publiée dans la revue Biocapteurs et bioélectronique visait à développer un nouveau biocapteur visuel alimenté par CRISPR-Cas12a pour la détection du SRAS-CoV-2.
Résultats de l’étude
L’acide ribonucléique (ARN) viral a été extrait, transcrit de manière inverse et amplifié à l’aide d’amorces spécifiques du gène SARS-CoV-2 N pour obtenir des amplicons d’acide désoxyribonucléique double brin (ADNdb). Le complexe Cas12a-crRNA a reconnu les amplicons d’ADNdb, à la suite de quoi le clivage trans de l’ADNsb a été initié.
Si l’ADNsb est marqué avec un fluorophore (F) à 5′ et un quencher (Q) aux extrémités 3′, le clivage conduit à un état non éteint. Cela a entraîné des signaux fluorescents améliorés qui ont été utilisés pour l’analyse quantitative de l’ADNdb cible. De plus, un ADNsb de liaison a été utilisé pour s’hybrider avec des paires de sondes AuNPs-ADN préfabriquées via un appariement de bases complémentaires.
En l’absence d’ADN cible, l’ADNsb du lieur resterait non coupé, ce qui entraînerait une agrégation induite par l’hybridation des sondes AuNPs qui pourraient subir un « pulldown ». Cela a entraîné un décalage vers le rouge de leur absorbance, rendant les solutions incolores après centrifugation.
En présence d’ADN cible, un clivage a eu lieu et il n’y a eu aucune agrégation de sondes AuNPs. Cela a entraîné la coloration de la solution après centrifugation.
Ces changements de couleur peuvent être capturés par un smartphone installé avec l’application Color Picker ou à l’œil nu. Ainsi, la détection du SARS-CoV-2 a eu lieu sur la base des changements de couleur.
CRISPR-Cas12a est-il réalisable pour la détection du SARS-CoV-2 ?
Pour déterminer la faisabilité de la détection basée sur CRISPR-Cas12a, l’ARNc a été conçu pour correspondre à une partie du gène de la nucléocapside (N). Les amorces d’ARNc et de PCR conçues étaient hautement conservées et alignées sur quelques-uns des coronavirus apparentés, notamment le syndrome respiratoire aigu sévère (SRAS-CoV), le syndrome respiratoire du Moyen-Orient (MERS-CoV) et les coronavirus humains (HumanCoV) pour l’évaluation de leur spécificité.
Suite à cela, quelques expériences préliminaires ont été réalisées sur le plasmide qui contenait le fragment de gène N du SARS-CoV-2. Les résultats de l’expérience ont indiqué que le clivage trans de Cas12a n’était déclenché qu’en présence des amplicons d’ADNdb et d’ARNc du gène N cible.
De plus, un test de sélectivité a été conçu qui a montré que les intensités de fluorescence de seuls les échantillons de SRAS-CoV-2 étaient augmentées. Cela a démontré que la sélectivité était élevée sans réaction croisée des cibles non-SARS-CoV-2.
De plus, la détection de l’ARN du SRAS-CoV-2 a eu lieu à l’aide du complexe Cas12a-crRNA. Les résultats ont indiqué qu’il y avait une relation linéaire entre l’ARN et les intensités de fluorescence.
La détection du SARS-CoV-2 a été stimulée par la production de lentivirus hébergeant des fragments génomiques (gène N) du SARS-CoV-2. Les résultats du test ont indiqué que le clivage trans de CRISPR-Cas12a pourrait être utile pour la détection du SRAS-CoV-2. De plus, il a également été constaté que les performances du test de fluorescence CRISPR-Cas12a étaient tout à fait comparables à celles de l’analyse qRT-PCR traditionnelle.
Pour effectuer une détection rapide du SARS-CoV-2, une méthode de détection visuelle a été développée, indépendante du lecteur de microplaques et pouvant être facilement lue à l’aide d’un smartphone. Par conséquent, le biocapteur proposé a été testé avec des pseudovirus contenant le fragment N.
Les résultats ont indiqué que le tube dépourvu d’acides nucléiques spécifiques au SRAS-CoV-2 était incolore après centrifugation. Comparativement, le tube qui contenait des acides nucléiques spécifiques au SARS-CoV-2 présentait un degré de changement de couleur qui dépendait de la concentration du SARS-CoV-2.
La détection sans amplification des pseudovirus SARS-CoV-2 a indiqué que la limite de détection (LOD) était de 106 copie/microlitre (μL), ce qui était bien supérieur à l’amplification adoptée pour la détection. De plus, une corrélation linéaire existait entre la concentration du pseudovirus. Les valeurs de luminosité ont été obtenues par l’appareil photo du smartphone.
De plus, les biocapteurs fluorescents et visuels CRISPRCas12a ont une cohérence de 100 % avec la qPCR. L’aire sous la valeur de la courbe (AUV) était meilleure pour cette méthode par rapport à la qPCR.
La répétabilité et la reproductibilité sont considérées comme importantes pour le développement de biocapteurs. L’étude des valeurs des écarts types relatifs (RSD) s’est avérée inférieure à 6 %, ce qui correspondait à une répétabilité et une reproductibilité acceptables.
Deux smartphones différents avec des appareils photo différents ont été utilisés pour déterminer si la différence de lumière et d’appareil photo pouvait produire des écarts dans les résultats. Bien que les deux caméras aient produit une légère variation, elles n’étaient pas statistiquement significatives. Cela suggère que le biocapteur proposé pourrait être utilisé avec différents smartphones et des conditions d’éclairage variables.
L’étude actuelle a porté sur 50 échantillons respiratoires cliniques, dont 20 ont été affectés par COVID-19, et 30 ont été obtenus à partir de sujets sains. Les échantillons d’ARN obtenus de tous les sujets ont été inversement transcrits et amplifiés par PCR.
Les produits de PCR ont ensuite été testés par un biocapteur visuel alimenté par CRISPR-Cas12a. Les résultats ont indiqué que le biocapteur visuel CRISPR-Cas12a était capable d’identifier et de différencier correctement les 50 échantillons positifs et négatifs, tout comme les résultats qPCR traditionnels.
Limites
Bien que la présente étude ait été assez efficace pour déterminer le potentiel du biocapteur visuel CRISPR-Cas12a dans la détection du SRAS-CoV-2, elle présentait certaines limites.
Premièrement, l’amplification PCR nécessite des cycles thermiques qui pourraient être remplacés par une technologie d’amplification isotherme. Deuxièmement, le biocapteur comprenait un transfert de liquide en plusieurs étapes qui pourrait être intégré dans une réaction à un seul pot, ce qui aiderait à minimiser l’instrumentation et à simplifier la procédure.
