L'édition génique pour le développement de nouveaux traitements et pour étudier la maladie ainsi que la fonction normale chez l'homme et d'autres organismes, pourrait progresser plus rapidement avec un nouvel outil pour couper de plus gros morceaux d'ADN du génome d'une cellule, selon une nouvelle étude réalisée par Scientifiques de l'UC San Francisco.
Publication de l'étude UCSF le 19 octobre 2020 dans la revue Méthodes de la nature intervient moins de deux semaines après que deux chercheurs qui ont utilisé pour la première fois les ciseaux génétiques CRISPR-Cas9 ont été sélectionnés pour recevoir le prix Nobel de chimie de cette année.
Bien que maintenant utilisé comme outil de recherche dans les laboratoires du monde entier, CRISPR a évolué il y a des éternités dans les bactéries comme un moyen de combattre leurs anciens néméses, une multitude de virus appelés bactériophages.
Lorsque les bactéries rencontrent un phage, elles incorporent un peu d'ADN viral dans leur propre ADN, et il sert ensuite de matrice pour fabriquer de l'ARN qui se lie à l'ADN viral correspondant dans le phage lui-même. Les enzymes CRISPR ciblent, désactivent et tuent le phage.
Dans ses derniers travaux explorant cette ancienne et étrange course aux armements, le chercheur principal Joseph Bondy-Denomy, PhD, professeur agrégé au Département de microbiologie et d'immunologie de l'UCSF, a rejoint les scientifiques Bálint Csörg?, PhD, et Lina León pour développer et tester un nouveau CRISPR outil.
L'ensemble CRISPR-Cas9, déjà renommé, est comme un ciseau moléculaire qui peut être utilisé pour exciser rapidement et précisément un petit morceau d'ADN sur un site ciblé.
D'autres méthodes peuvent alors être utilisées pour insérer un nouvel ADN. Mais le nouveau système CRISPR-Cas3 adapté par les scientifiques de l'UCSF utilise un système immunitaire bactérien différent. L'enzyme clé de ce système, Cas3, agit davantage comme une déchiqueteuse de bois moléculaire pour éliminer rapidement et précisément des segments d'ADN beaucoup plus longs.
Cas3 est comme Cas9 avec un moteur – après avoir trouvé sa cible ADN spécifique, il fonctionne sur l'ADN et le mâche comme un Pac-Man. «
Joseph Bondy-Denomy, PhD, chercheur principal et professeur agrégé, Département de microbiologie et d'immunologie, Université de Californie – San Francisco
Cette nouvelle capacité de supprimer ou de remplacer de longs segments d'ADN permettra aux chercheurs d'évaluer plus efficacement l'importance des régions génomiques contenant des séquences d'ADN à fonction indéterminée, selon Bondy-Denomy, une considération importante dans la compréhension des humains et des agents pathogènes qui les infestent.
« Auparavant, il n'existait pas de moyen simple et fiable de supprimer de très grandes régions d'ADN dans les bactéries à des fins de recherche ou thérapeutiques », a-t-il déclaré. « Maintenant, au lieu de faire 100 petites suppressions d'ADN différentes, nous pouvons simplement faire une suppression et demander: 'Qu'est-ce qui a changé?' »
Comme les bactéries et autres types de cellules sont couramment utilisés pour produire des produits pharmaceutiques à base de petites molécules ou de protéines, CRISPR-Cas3 permettra aux scientifiques de l'industrie biotechnologique d'éliminer plus facilement l'ADN potentiellement pathogène ou inutile de ces cellules, selon Bondy-Denomy.
« De larges pans d'ADN bactérien sont mal compris, avec des fonctions inconnues qui, dans certains cas, ne sont pas nécessaires à la survie », a déclaré Bondy-Denomy. « De plus, l'ADN bactérien contient de grandes étendues d'ADN importées d'autres sources, qui peuvent provoquer des maladies chez l'hôte humain de la bactérie ou détourner le métabolisme bactérien. »
CRISPR-Cas3 devrait également permettre l'insertion de gènes entiers dans le génome dans des applications industrielles, agricoles ou même de thérapie génique humaine, a déclaré Bondy-Denomy.
Les chercheurs de l'UCSF ont sélectionné et modifié le système CRISPR-Cas3 utilisé par la bactérie Pseudomonas aeruginosa, et ont démontré chez cette espèce et chez trois autres, y compris des bactéries qui causent des maladies chez l'homme et les plantes, que leur version plus compacte fonctionne bien pour éliminer l'ADN sélectionné dans les quatre espèces.
D'autres systèmes CRISPR-Cas3 ont été conçus pour fonctionner dans des cellules humaines et d'autres mammifères, et cela devrait également être réalisable pour le système P. aeruginosa modifié, a déclaré Bondy-Denomy.
Bondy-Denomy étudie une gamme de bactéries, de bactériophages et de systèmes CRISPR pour en savoir plus sur leur fonctionnement et pour trouver des outils moléculaires utiles.
« CRISPR-Cas3 est de loin le système CRISPR le plus courant dans la nature », a-t-il déclaré. « Environ 10 fois plus d'espèces bactériennes utilisent un système Cas3 que l'utilisation d'un système Cas9. Il se peut que Cas3 soit un meilleur système immunitaire bactérien parce qu'il déchiquette l'ADN phagique. »
Contrairement à Cas9, lorsque Cas3 se lie à sa cible ADN précise, il commence à mâcher un brin de l'ADN double brin dans les deux sens, laissant un seul brin exposé.
Les délétions obtenues dans les expériences UCSF variaient en taille, englobant dans de nombreux cas jusqu'à 100 gènes bactériens. Le mécanisme CRISPR-Cas3 devrait également permettre un remplacement plus facile de l'ADN supprimé par une nouvelle séquence d'ADN, ont découvert les chercheurs.
Pour la suppression et l'édition d'ADN en laboratoire, les scientifiques programment les systèmes CRISPR pour cibler un ADN spécifique dans le génome d'un organisme d'intérêt en utilisant n'importe quelle séquence guide de leur choix.
Dans la nouvelle étude CRISPR-Cas3, en manipulant les séquences d'ADN fournies aux bactéries pour réparer les délétions, les chercheurs ont pu définir avec précision les limites de ces grandes réparations d'ADN, ce qu'ils n'ont pas pu accomplir avec CRISPR-Cas9.
Bondy-Denomy a déjà découvert des stratégies anti-CRISPR qui phages ont évolué pour lutter contre les bactéries, et celles-ci pourraient s'avérer utiles pour arrêter les réactions d'édition de gènes induites par les enzymes Cas utilisées comme thérapies humaines avant que les effets secondaires ne surviennent, ou pour utiliser des phages pour éliminer les bactéries indésirables. qui ont peuplé l'intestin, dit-il.
Hormis E. coli et quelques autres espèces, on en sait relativement peu sur les quelque 1 000 espèces bactériennes qui y résident normalement.
«Les microbes non modèles ont été largement laissés pour compte dans le monde de la génétique, et il y a un énorme besoin de nouveaux outils pour les étudier», a-t-il déclaré.
La source:
Université de Californie – San Francisco
Référence du journal:
Csörgő, B., et al. (2020) Un système Cascade-Cas3 compact pour l'ingénierie ciblée du génome. Méthodes de la nature. doi.org/10.1038/s41592-020-00980-w.
