Dans une étude récente publiée dans Micromachinesles chercheurs ont évalué l’efficacité d’un système de décodage génétique pour diagnostiquer le cancer du poumon non à petites cellules (NSCLC).
Sommaire
Arrière-plan
Le NSCLC est l’une des principales causes de mortalité liée au cancer dans le monde. Le ciblage de la sensibilisation induite par la mutation génique du récepteur du facteur de croissance épidermique (EGFR) avec un inhibiteur de la tyrosine kinase s’est avéré être un traitement efficace pour le NSCLC. Par conséquent, la stratégie thérapeutique adaptée a souligné le besoin de technologies simples, rapides et intelligentes pour le décodage génétique de l’EGFR afin de faciliter la popularité de la médecine de précision.
À propos de l’étude
Dans la présente étude, les chercheurs ont combiné l’amplification isotherme médiée par boucle (LAMP) et le système de mutation réfractaire d’amplification (ARMS) pour produire OnePot-LAMP, une méthode simple, rapide et peu coûteuse pour le décodage intelligent de l’EGFR.
L’équipe a développé deux jeux d’amorces destinés au décodage EGFR L858R pour produire One-Pot-LAMP. Les variantes mutantes et de type sauvage sont respectivement abrégées « M » et « WT », par souci de simplicité dans cette étude. Le jeu d’amorces M se compose de deux amorces internes M et de deux amorces externes pour identifier la variante mutante. Le jeu d’amorces WT se compose de deux amorces internes et de deux amorces externes pour identifier le variant de type sauvage. De plus, deux amorces pour la synthèse de plasmide et le séquençage de l’acide désoxyribonucléique (ADN) ont été créées.
Deux plasmides portant les séquences EGFR de la mutation WT ou L858R ont été produits. Les plasmides recombinants récupérés ont ensuite été convertis en Escherichia coli Cellules DH5ɑ avant extraction. Tous les plasmides ont été validés par séquençage d’ADN, et leurs quantités ont été calculées. L’équipe a obtenu deux lignées cellulaires de cancer du poumon portant la mutation ponctuelle L858R (NCI-H1975) et la variante WT (A549) de l’EGFR en tant qu’échantillons positifs et négatifs, respectivement.
Au total, 40 personnes diagnostiquées avec un NSCLC ont subi une résection de tissu malin. Pour l’étude ultérieure, tous les tissus malins ont été fixés avec du formol et inclus avec de la paraffine. L’ADN génomique a été isolé à partir de lignées cellulaires et le tissu malin a été extrait. Lorsque le décodage EGFR L858R utilise cette approche, deux processus d’amplification parallèles sont effectués simultanément pour chaque échantillon en identifiant les variantes M et WT.
Résultats
Pour décoder la mutation EGFR L858R, deux amorces internes ont été conçues pour reconnaître le variant cible en fonction de leurs séquences d’ADN. Le nucléotide de mutation ponctuelle L858R a été placé entre les régions B1c et F1, les deux régions se chevauchant dans cette mutation. Ainsi, le nucléotide critique de l’ensemble d’amorces associé au décodage EGFR L858R a été construit à l’extrémité 50 située dans l’amorce interne.
Deux tests LAMP simultanés ont été utilisés pour déterminer le statut mutant de la mutation L858R dans l’EGFR. En particulier, des structures à double tige-boucle ont été générées en déplaçant des brins dans les mélanges réactionnels et ont fonctionné comme catalyseur pour la synthèse d’ADN auto-amorcée. L’équipe a noté qu’une structure à double tige-boucle composée de nucléobases complémentaires à la variante cible émergerait dans le tube de variante d’amorce assortie. À son tour, cela conduit à une amplification exponentielle de l’ADN ainsi qu’à l’accumulation d’ADN tige-boucle avec des longueurs de tige variables.
Dans le tube amorce-variante incompatible, une structure à double tige-boucle comprenant une nucléobase non complémentaire émergerait, empêchant la synthèse d’ADN auto-amorçante. Ainsi, la courbe cinétique d’amplification en forme de S obtenue à partir de l’amplification exponentielle de l’ADN ne serait visible que si l’échantillon avait le variant correspondant à l’ensemble d’amorces.
La variante M a entraîné une amplification importante du signal dans le tube M, tandis que la variante WT a entraîné une amplification exclusivement dans le tube WT. Par rapport à la paire amorce-variante incompatible, l’équipe a observé que les paires amorce-variante appariées généraient une grande courbe cinétique d’amplification en forme de S, facilitant la détermination du statut de mutation de l’EGFR. Considérant le contrôle négatif, les courbes cinétiques d’amplification pour les tubes M et WT étaient cohérentes avec celles notées pour la paire amorce-variante non concordante.
Les performances de One-Pot-LAMP ont été évaluées dans des conditions idéales et des plasmides ont été utilisés comme standard de contrôle de séquence. Le mélange plasmidique total a été utilisé dans le mélange réactionnel pour évaluer la capacité de la méthode à identifier le variant cible en présence d’un fond interférentiel.
Même lorsque la concentration de plasmide cible était d’environ 0,1 %, des courbes cinétiques d’amplification en forme de S remarquables ont été trouvées pour tous les échantillons de test contenant le variant cible dans les 40 minutes. Cependant, il n’y avait pas de signal d’amplification pour le mélange plasmidique qui ne contenait pas de variant cible, démontrant l’excellente sensibilité ainsi que la spécificité de cette approche.
Conclusion
Les résultats de l’étude ont montré que One-Pot-LAMP offrait une grande sensibilité et spécificité tout en étant facilement adapté pour le décodage d’informations génétiques supplémentaires en reconcevant les ensembles d’amorces. À l’aide de données du monde réel, les performances de One-Pot-LAMP pour détecter la mutation EGFR L858R ont été validées, indiquant la promesse significative de cette méthode simple pour le diagnostic du NSCLC dans la pratique clinique.
