Dans une étude récente publiée dans le Nature Ingénierie biomédicaleun groupe de chercheurs a optimisé l'édition principale (PE) pour la correction efficace de la mutation F508del du régulateur de conductance transmembranaire de la fibrose kystique (FK) (CFTR) (une délétion de trois nucléotides qui est la cause prédominante de la FC) dans les cellules épithéliales des voies respiratoires humaines, obtenant des efficacités de correction élevées et une restauration fonctionnelle avec des effets hors cible minimes.
Sommaire
Arrière-plan
Le PE permet une édition précise du génome sans avoir recours à un double brin acide désoxyribonucléique (ADN) cassures, réduisant le risque d'édition par des témoins ou hors cible. Contrairement aux méthodes à médiation par nucléase, la PE minimise les indels incontrôlés, les délétions importantes, l'activation de p53, l'insertion de rétrotransposons et les défauts chromosomiques. Elle ne nécessite pas de modèles d'ADN donneur et est efficace dans les cellules mitotiques et non mitotiques, avec des applications réussies in vivo chez la souris et les primates non humains.
En combinant une nickase programmable, une transcriptase inverse et un guide PE acide ribonucléique (ARN), la PE corrige efficacement les mutations pathogènes. Des recherches supplémentaires sont nécessaires pour améliorer son efficacité, son applicabilité et sa sécurité en milieu clinique.
À propos de l'étude
Les plasmides d'expression d'ARN guide, notamment les ARN guide d'édition primaire (pegRNA), les ARN peg (e) conçus, les ARN guide de coupure (ng), les ARN guide unique mort (dsg) et les ARN guide unique (sg), ont été clonés et purifiés à l'aide de kits standard. L'amplification par réaction en chaîne par polymérase de l'ADN (PCR) a utilisé le mélange maître PCR multiplex Phusion U Green. Les pegRNA et epegRNA synthétiques présentaient des modifications spécifiques et provenaient d'Agilent Research Labs, de Synthego et d'Integrated DNA Technologies.
L'éditeur principal et les ARN messagers associés (m) ont été générés par transcription in vitro et purifiés. Les cellules HEK293T (Human Embryonic Kidney Cells) de l'American Type Culture Collection ont été cultivées dans un milieu Eagle modifié, tandis que les cellules 16HBEge-F508del (Immortalized Human Bronchial Epithelial Cells Homozygotes for CFTR F508del Mutation) de la Cystic Fibrosis Foundation ont été cultivées dans un milieu essentiel. Les cellules épithéliales primaires des voies respiratoires ont été isolées à partir de donneurs, développées et différenciées dans un milieu PneumaCult Air-Liquid Interface Medium (PneumaCult-ALI).
Les cellules HEK293T ont été transfectées à l'aide de Lipofectamine 2000 avec des quantités spécifiques de plasmides et incubées pendant 72 heures. Les cellules épithéliales des voies respiratoires primaires et 16HBEge-F508del ont été électroporées avec des réactifs PE RNA et cultivées. L'ADN génomique a été extrait à l'aide de protocoles de lyse personnalisés et le tri cellulaire activé par fluorescence a préparé les cellules pour le tri.
Le séquençage à haut débit (HTS) des loci génomiques a nécessité deux cycles de PCR avec des amorces à code-barres Illumina, et CRISPResso2 a été utilisé pour analyser l'efficacité de l'édition et les indels. Une lignée cellulaire homozygote CFTR F508del HEK293T a été créée via la transfection de la stratégie PE2 et la dilution limitante.
Les séquences de pegRNA ont été conçues à l'aide de DeepPrime et de Prime Editing Rational Design and Implementation Computational Tool Version 2.0 (PRIDICT 2.0), synthétisées et testées. Les tests en chambre d'Ussing ont évalué l'activité du canal CFTR. La désignation du site hors cible a été réalisée avec la circularisation pour le reporting in vitro des effets de clivage par séquençage (CIRCLE-seq), et les sites principaux ont été analysés pour les indels et les substitutions à l'aide de HTS.
Résultats de l'étude
L'équipe a cherché à corriger la mutation CFTR F508del peu après que la PE ait été initialement signalée en 2019. Ils ont d'abord généré une lignée cellulaire clonale HEK293T homozygote pour cette délétion dans le gène CFTR endogène. À l'aide de cette lignée cellulaire, ils ont criblé des pegRNA avec différentes longueurs de site de liaison d'amorce (PBS) et de modèle de transcription inverse (RTT) sur deux proto-espaceurs proximaux de F508del (NGG1 et NGG2). Ils n'ont observé aucune correction avec les pegRNA NGG1, probablement en raison d'une séquence TTTT agissant comme terminateur transcriptionnel. Une correction a été détectée avec les pegRNA NGG2, mais l'efficacité de l'édition n'a pas dépassé 0,2 %.
Pour améliorer la correction, un criblage PE3 de deux pegRNA NGG2 a été effectué contre divers protospacers ngRNA. Alors que le meilleur pegRNA NGG2 PE3 a montré une amélioration par rapport au PE2, l'édition moyenne maximale n'a pas dépassé 0,5 %. On a émis l'hypothèse qu'une correction inefficace pourrait être due à l'état de la chromatine affectant l'accessibilité du site d'édition aux effecteurs Cas. Une édition efficace A•T-toG•C à l'aide d'un éditeur de base d'adénine (ABE) a confirmé que NGG1 et NGG2 étaient accessibles aux effecteurs Cas guidés par pegRNA.
Plusieurs avancées dans le domaine de la PE ont été réalisées, notamment les ARNpeg avec des motifs pseudo-nœuds d'ARN pour protéger contre la dégradation par exonucléase, l'inhibition de la réparation des mésappariements de l'ADN (MMR) à l'aide de MLH1dn et la protéine d'édition principale PEmax. La suite PE6, comprenant des RT évoluées en laboratoire et des domaines d'édition principale Cas9, a également été introduite.
En combinant ces améliorations, l'équipe a examiné 178 ARNpeg avec différentes longueurs de PBS et de RTT sur sept proto-espaceurs, y compris les motifs NGG et les motifs adjacents aux proto-espaceurs reconnus par une variante modifiée de Cas9 (NGA PAM). La stratégie de désignation spécifique d'un ARN guide d'édition principal avec une longueur de site de liaison d'amorce de 13 et une longueur de modèle de transcription inverse de 41 (NGG2 PBS13 RTT41) a montré une amélioration significative des taux d'édition.
Le développement ultérieur a consisté à tester les ngRNA des expériences PE3 précédentes avec l'epegRNA NGG2 PBS13 RTT41 dans une expérience PE5max. Cela a permis d'identifier un pseudo +104 qui a amélioré l'efficacité de l'édition à 0,86 %. L'ajout de modifications silencieuses qui ont perturbé le PAM de NGG2 et installé des modifications supplémentaires autour de celui-ci a encore amélioré l'efficacité. La meilleure stratégie, SE2, a abouti à un taux d'édition moyen de 6,8 %, soit une amélioration de cinq fois par rapport aux tentatives précédentes.
L'équipe a également évalué les variantes PE6 récemment évoluées, constatant que PE6b et PE6c amélioraient encore la correction F508del. En utilisant l'epegRNA optimisé avec MLH1dn et le +104 ngRNA, PE6c a atteint les taux d'édition les plus élevés. Dans les cellules 16HBEge-F508del, la combinaison d'epegRNA, d'éditions silencieuses, de variantes PE6 et d'ARNdsg a considérablement amélioré l'efficacité de l'édition. La stratégie la plus efficace a atteint un taux moyen de correction F508del de 51 %.
Les tests de cette stratégie sur des cellules épithéliales primaires des voies respiratoires de patients atteints de mucoviscidose ont abouti à un taux de correction moyen de 25 %, avec une récupération substantielle de l'activité du canal CFTR. Les analyses sur cible et hors cible ont indiqué des résultats d'édition involontaires minimes, démontrant la précision de la stratégie et son potentiel d'application thérapeutique.
Conclusions
Pour résumer, les expériences initiales PE3 ont donné lieu à une correction moyenne de 0,42 %, tandis que l'application des avancées récentes, notamment les pegRNA modifiés (epegRNA), PEmax, MLH1dn, les modifications silencieuses, PE6 et les dsgRNA, a conduit à une correction moyenne allant jusqu'à 11 %, 58 % et 25 % dans les cellules HEK293T, 16HBEge-F508del et les cellules épithéliales primaires des voies respiratoires des patients atteints de mucoviscidose, respectivement.
Ces améliorations ont entraîné des effets hors cible minimes (≤ 0,1 %). Le système PE optimisé offre un rapport correction/indel élevé sans cassures d'ADN double brin ni modèles d'ADN, simplifiant ainsi les applications cliniques potentielles pour le traitement de la fibrose kystique.
