Une étude récente publiée dans le Talante La revue a signalé le développement de capteurs colorimétriques pour la détection des gènes de l’ARN polymérase (RdRp), de l’enveloppe (E) et de la pointe (S) du syndrome respiratoire aigu sévère coronavirus 2 (SARS-CoV-2) dépendant de l’acide ribonucléique (ARN).
Sommaire
Contexte
La réaction en chaîne par polymérase de transcription inverse quantitative (RT-qPCR) a été largement utilisée pour détecter l’infection par la maladie à coronavirus 2019 (COVID-19) en raison de sa sensibilité et de sa spécificité élevées. Cependant, cette technique nécessite une intervention professionnelle et un équipement sophistiqué tout en étant chronophage et coûteuse.
À propos de l’étude
La présente étude a montré le développement d’un test colorimétrique utilisant des nanoparticules d’or (AuNPs) pour la détection de séquences codant pour les protéines SARS-CoV-2 RdRp, E et S.
Des balises moléculaires (MB) spécifiques aux séquences des gènes E et R, de la protéine S ou de la mutation D614G et des AuNP de tailles variables ont été générés. La taille et la forme de l’AuNP ont été étudiées à l’aide de la microscopie à force atomique (AFM) et de la microscopie électronique à transmission (TEM). Les AuNPs ont ensuite été visualisés, suivis de la préparation des échantillons. La taille et la concentration des AuNPs dans les échantillons ont été déterminées à l’aide des spectres ultraviolet-visible (UV-Vis).
L’équipe a fonctionnalisé les AuNPs stabilisés au citrate à l’aide de divers oligonucléotides MB après avoir déterminé le nombre d’oligonucléotides pouvant être conjugués aux AuNPs. Ainsi, différents NP contenaient un, deux ou trois MB dans leur structure. La fonctionnalité du capteur AuNP-MB a été évaluée via des photographies pour des calculs qualitatifs et des mesures d’absorbance pour l’évaluation quantitative pour des périodes allant de 15 minutes à 24 heures. Les échantillons prélevés chez les patients ont été amplifiés à l’aide de la réaction en chaîne de transcription inverse-polymérase (RT-PCR).
Résultats
Les résultats de l’étude ont montré que les oligonucléotides utilisés pour la production d’AuNP avaient deux domaines différents, parmi lesquels le central était complémentaire des régions cibles du génome du SRAS-CoV-2. Les nucléotides flanquants (nt) présents dans ce domaine ont stabilisé la structure oligonucléotidique et permis la reconnaissance sélective des séquences cibles dans le génome viral. Les dérivés de soufre et de cholestérol présents à chaque extrémité de l’oligonucléotide étaient nécessaires à la conjugaison des structures NP-oligonucléotide et à l’agrégation des NP.
La spécificité des MB dépendait de leur conception de séquence et de leur comportement thermodynamique. Parmi les paramètres de conception de séquence, la longueur de la tige du MB a déterminé sa cinétique et sa stabilité. Le test de la fonctionnalité d’AuNP de 21 nanomètres (nm) avec différentes longueurs de tige MB a montré que tous les capteurs pouvaient reconnaître sélectivement les séquences cibles d’acide désoxyribonucléique (ADN) tandis que la tige avec cinq nt prenait le moins de temps pour détecter les cibles d’ADN et était donc sélectionné pour le reste de l’étude.
L’analyse de l’impact de la taille de l’AuNP sur la détection de l’ADN a montré que le plus grand NP d’une taille de 38 nm avait une sensibilité plus élevée et une stabilité inférieure par rapport aux NP de 21 nm. De plus, les AuNP de 15 nm étaient plus stables et prenaient plus de temps pour détecter l’ADN cible. Enfin, les AuNP entre 20 et 25 nm ont été considérés comme optimaux pour le reste de l’étude en fonction de leur stabilité et de leur sensibilité.
La haute sélectivité des AuNps a été démontrée par l’agrégation attendue des AuNP observée uniquement en présence d’une cible spécifique du SRAS, indépendamment de la présence d’autres micro-organismes. La détection efficace des séquences cibles à faible nm a indiqué une sensibilité élevée du capteur AuNP-MB qui a été encore améliorée lorsque le système a combiné deux séquences liées au SARS-CoV-2. De plus, la durée de stockage des capteurs n’a eu aucun effet sur leur fonctionnalité même lorsqu’ils ont été stockés pendant trois mois à des températures de stockage de 4°C.
La caractérisation biophysique du capteur a montré une réduction de l’absorbance en présence d’agrégation de NP tandis qu’une nette dispersion des NP a été observée en l’absence de toute cible. En outre, une augmentation de la taille des NP a été constatée dans les échantillons contenant des cibles d’ADN. De plus, l’étude a montré que l’interaction entre la boucle structurelle du capteur et la cible, ainsi que l’interaction capteur-groupement cholestérol accéléraient le processus d’agrégation.
Le capteur avait une limite de détection de 7,8 x 107 à 9,6 x 107 copies de virus par millilitre (mL) tandis que les charges virales du SRAS-CoV-2 dans les échantillons prélevés cinq à six jours après l’apparition des symptômes avaient 104 à 107 copies par ml, indiquant ainsi que le capteur pouvait détecter avec précision le virus dans de tels échantillons. Cependant, l’étude a observé que la structure complexe de l’ARN viral pourrait potentiellement réduire la sensibilité du capteur. Cela a été annulé en utilisant une amplification basée sur la réaction en chaîne par polymérase modifiée (PCR) après la transcription de l’ARN. Cette méthode a fourni de courts amplicons simple brin qui ont permis une détection facile avec une sensibilité suffisante.
Conclusion
Les découvertes d’étude ont prouvé que l’approche de sonde modifiée avec la production d’amplicon pourrait trouver la présence de SARS-CoV-2 en échantillons avec des charges virales variables. Les chercheurs pensent que ce capteur pourrait être modifié pour cibler n’importe quelle région du génome du SRAS-CoV-2 pour une détection spécifique des acides nucléiques à des fins de diagnostic.
