Dans une étude récente publiée dans Biologie Cellulaire Natureles chercheurs ont évalué l’association entre l’infection par le coronavirus du syndrome respiratoire aigu sévère 2 (SRAS-CoV-2) et les dommages causés par l’acide désoxyribonucléique (ADN) et la sénescence cellulaire.
Sommaire
Arrière-plan
Plusieurs mécanismes cellulaires, tels que la voie de l’autophagie, la réponse aux dommages de l’ADN et le système ubiquitine-protéasome (UPS), peuvent être affectés par les infections virales (DDR). Bien que l’interaction entre le DDR et certains virus à ADN ait été examinée, on en comprend beaucoup moins sur les virus à acide ribonucléique (ARN).
Il a été proposé que l’infection par le SRAS-CoV-2 engage des composants impliqués dans la machinerie DDR ; cependant, une caractérisation complète et une enquête mécaniste de l’effet de l’infection par le SRAS-CoV-2 sur l’engagement du DDR et l’intégrité du génome font défaut.
À propos de l’étude
Dans la présente étude, les chercheurs ont démontré que le SRAS-CoV-2 endommage l’ADN et déclenche une réponse altérée aux dommages à l’ADN.
L’immunobuvardage a été utilisé pour examiner l’activation des voies DDR dans une lignée cellulaire humaine appelée Huh7, qui permet naturellement le SRAS-CoV-2 à divers moments après l’infection par le SRAS-CoV-2. Comme contrôle négatif, l’équipe a utilisé des cellules infectées par un faux. D’autre part, en tant que contrôle positif, les cellules ont été soumises à de l’hydroxyurée (HU), qui génère un stress de réplication de l’ADN et provoque l’axe de l’ataxie télangiectasie et de la kinase 1 (CHK1) du point de contrôle liée à Rad3 (ATR), ou des rayonnements ionisants (IR ), qui provoque des cassures double brin (DSB) et stimule la voie ataxie-télangiectasie mutée (ATM)-CHK2.
Des enquêtes quantitatives d’immunofluorescence ont été menées pour confirmer et étendre l’effet de l’infection par le SRAS-CoV-2 à la résolution unicellulaire sur le DDR. L’équipe a examiné le stimulateur cyclique de la guanosine monophosphate–adénosine monophosphate synthase (cGAS) des gènes de l’interféron (STING) ainsi que d’autres voies inflammatoires dans les cellules infectées par le SRAS-CoV-2.
En outre, la réaction en chaîne par polymérase quantitative de transcription inverse (RT-qPCR), l’immunofluorescence et l’immunoempreinte ont été utilisées pour déterminer les quantités d’ARN messager et de protéines de la ribonucléotide réductase M2 (RRM2). Pour évaluer si l’épuisement de CHK1 est suffisant pour recréer les événements après l’infection par le SRAS-CoV-2, les chercheurs ont étudié l’effet de l’épuisement de CHK1 par interférence ARN.
Pour identifier les produits géniques viraux qui causent la régulation négative de CHK1, l’équipe a exprimé 24 des 26 protéines SARS-CoV-2 identifiées et a analysé leur effet sur les niveaux de CHK1 à l’aide d’un immunotransfert.
Résultats
L’infection par le SRAS-CoV-2 a induit l’autophosphorylation et la stimulation conséquente des kinases maîtresses ADN-protéine kinase et ATM, mais pas de l’ATR. CHK2, la cible immédiate en aval d’ATM, n’a pas été phosphorylée au niveau de son site d’activation, et CHK1 non plus. De plus, P53 n’était pas largement phosphorylé sur S15, un site cible pour ATM/ATR. La protéine 1 associée à la boîte associée à Kruppel (KAP1), une cible ATM liée à la chromatine, était significativement phosphorylée aux côtés de ƔH2AX phosphorylé et de la protéine de réplication A (RPA), indicateurs de ruptures double brin et de ruptures simple brin, respectivement.
Des cellules épithéliales pulmonaires humaines infectées Calu-3 ont produit des résultats comparables. L’infection des cellules primaires épithéliales nasales humaines (HNEpC) avec l’activation de la DDR confirmée par le SRAS-CoV-2, comme indiqué par les foyers pRPAS4/8 et H2AX. Comme évalué par le moment de la queue, la fragmentation de l’ADN a été induite dans les deux lignées cellulaires infectées par le SRAS-CoV-2 par rapport aux conditions de contrôle.
Dans les cellules Calu-3, un nombre accru de micronoyaux colorés positivement pour le cGAS a suggéré la génération d’ADN nucléaire endommagé dans le cytosol. Dans les cellules Huh7 infectées par le SRAS-CoV-2, qui n’exprimaient pas cGAS et STING32, les facteurs responsables de la réponse pro-inflammatoire, à savoir P38 et le transducteur de signal et l’activateur de la transcription 1 (STAT1), ont été activés.
Suite à l’infection par le SRAS-CoV-2, l’équipe a observé une baisse constante et considérable de leur nombre. Un déficit en désoxynucléoside triphosphate (dNTP) peut entraver la synthèse de l’ADN, empêchant ainsi la progression de la phase S. Par rapport aux échantillons témoins, les chercheurs ont détecté une concentration considérable de cellules infectées en phase S. En outre, une augmentation de la proportion de cellules en phase S BrdU négatives dans les échantillons infectés a été notée. Après l’infection, ces résultats indiquent une diminution des niveaux de dNTP et un développement de la phase S entravé.
La cytométrie en flux a démontré que les cellules renversées pour CHK1 se sont agrégées en phase S. Le marquage par impulsions avec BrdU avant l’analyse par cytométrie en flux a révélé une plus grande proportion de cellules en phase S BrdU négatives par rapport aux échantillons témoins. L’équipe a également noté que l’épuisement de CHK1 était suffisant pour diminuer les niveaux de RRM2 et entraîner des dommages à l’ADN.
De plus, l’inactivation de CHK1 a entraîné l’activation de STAT1 et P38 ainsi que la génération de foyers et de micronoyaux H2AX qui étaient fréquemment positifs pour le cGAS. Cela a indiqué que l’appauvrissement en CHK1 dans les cellules infectées a probablement contribué à la stimulation des voies pro-inflammatoires. Comme le montrent les immunoessais, les cellules appauvries en CHK1 ont démontré une expression accrue de la majorité des gènes de cytokines et de chimiokines ainsi qu’une sécrétion accrue d’interleukine (IL)-6, CXCL9 et CXCL10 dans les cellules Calu-3.
ORF6 et NSP13 étaient les produits géniques étudiés ayant l’effet le plus robuste et le plus cohérent sur les niveaux de protéine CHK1. De plus, leur expression seule était suffisante pour diminuer les niveaux de RRM2 et améliorer la phosphorylation de gamma-H2AX et de RPA. Il a été démontré que l’ORF6 du SRAS-CoV-2 est associé au pore nucléaire et interfère avec le transport nucléaire-cytoplasmique des protéines.
conclusion
Les résultats de l’étude ont montré que les dommages à l’ADN induits par le SRAS-CoV-2 activaient une voie pro-inflammatoire intrinsèque aux cellules qui, en conjonction avec la réponse immunologique, a généré la réponse inflammatoire intense trouvée chez les patients COVID-19.
L’équipe a présenté un modèle pour améliorer la connaissance de la sénescence cellulaire induite par le SRAS-CoV-2 en fournissant un mécanisme de création de dommages à l’ADN et de stimulation des voies DDR ainsi qu’un programme pro-inflammatoire.
