Fin décembre 2019, la maladie à coronavirus 2019 (COVID-19) a été détectée pour la première fois dans la ville de Wuhan, en Chine, provoquant une maladie respiratoire facilement transmissible. En mars 2020, l’Organisation mondiale de la santé (OMS) a déclaré sa flambée de pandémie mondiale.
Causé par le coronavirus 2 du syndrome respiratoire aigu sévère (SRAS-CoV-2), le COVID-19 a infecté plus de 107,48 millions de personnes dans le monde. À ce jour, plus de 2,35 millions sont déjà morts.
Au fur et à mesure de l’évolution de la pandémie, le virus s’est transformé en variantes qui sont plus facilement transmissibles et peuvent potentiellement provoquer des symptômes plus graves.
Flux de travail pour le séquençage du génome viral du SRAS-CoV-2 avec un instrument MinION.
À présent, des chercheurs de la Southern Illinois University, États-Unis, ont présenté un ensemble complet et bien validé de protocoles de travail pour le séquençage de génomes de SRAS-CoV-2 de haute qualité à haut débit à partir d’échantillons de patients. Cela peut aider à effectuer le séquençage du génome viral, ce qui peut aider à déterminer les mutations du virus et aider les gouvernements à planifier la mise en œuvre de mesures pour endiguer la pandémie.
Séquençage du génome viral
Il est essentiel d’effectuer le séquençage du génome viral pour aider à résoudre les problèmes potentiels pouvant survenir avec de nouvelles mutations du virus. Les virus peuvent évoluer rapidement, ce qui peut entraîner une transmissibilité ou une virulence accrue et constituer une menace sérieuse pour les populations du monde entier.
Le SARS-CoV-2 a deux nouvelles variantes qui sont plus transmissibles et peuvent potentiellement causer des symptômes plus graves. La variante britannique s’est déjà répandue dans d’autres pays, provoquant une flambée des cas dans des endroits comme les États-Unis, tandis que la variante sud-africaine peut échapper aux anticorps produits grâce à la vaccination.
Par conséquent, le séquençage du génome viral peut délimiter des régions conservées et mutables qui pourraient fournir des informations précieuses sur le développement de vaccins et de traitements efficaces contre le SRAS-CoV-2.
Actuellement, il existe de nombreuses approches différentes pour séquencer les génomes du SRAS-CoV-2, telles que le séquençage métagénomique, les méthodes basées sur l’amplification par PCR et le séquençage d’enrichissement ciblé. Deux de ces méthodes, en particulier les génomes métagénomiques et cibles, sont coûteuses pour générer des génomes complets à grande échelle.
Pendant ce temps, une amplification basée sur la PCR peut être une solution potentielle pour remédier aux limites des autres méthodes. La méthode d’amplification basée sur la PCR amplifie la cible d’intérêt en même temps.
L’étude
Dans la présente étude, publiée sur le bioRxiv * serveur de pré-impression, les chercheurs ont introduit une méthode pour séquencer les génomes du SRAS-CoV-2 de haute qualité à partir d’échantillons de patients. Le laboratoire de l’équipe de recherche a adopté et modifié les protocoles, qui ont été développés par le réseau ARTIC pour séquencer les génomes viraux du SRAS-CoV-2 en utilisant la plate-forme de séquençage des nanopores MiniION d’Oxford Nanopore Technologies (ONT).
À partir de là, l’équipe a présenté une séquence validée complète, y compris un guide pratique pour chaque étape de l’extraction de l’acide ribonucléique viral (ARN) à la visualisation des données. L’équipe a validé les nouveaux protocoles en traitant avec succès plus de 1 000 échantillons et en séquençant plus de 600 génomes de SRAS-CoV-2 de haute qualité de l’Illinois.
Pour arriver aux résultats de l’étude, les chercheurs ont effectué l’ensemble du flux de travail pour produire des génomes du SRAS-CoV-2 dans un format de plaque à 96 puits. Cela commence par l’extraction de l’ARN à partir du milieu de transport viral (VTM) qui contient des écouvillons nasopharyngés (NP) dérivés du patient. Ensuite, l’équipe convertit l’ARN extrait en ADN complémentaire (ADNc), qui est utilisé pour l’approximation de la charge virale par PCR quantitative (qPCR).
Après avoir effectué la qPCR, les chercheurs ont amplifié l’ADNc du génome viral au format 96 puits pour réduire la contamination des séquences et augmenter le nombre de copies des génomes viraux. Dans cette méthode, les chercheurs ont utilisé deux pools d’amorces conçues par le réseau ARTIC.
Ensuite, l’équipe a réalisé une PCR multiplex avec deux pools d’amorces ARTIC, et les deux pools de produits PCR séparés pour chaque échantillon sont regroupés, tandis que les amplicons sont isolés via une étape de nettoyage.
Enfin, les génomes avec une couverture adéquate peuvent être vus et observés par des analyses phylogénétiques et des appels de variantes effectués à l’aide d’outils Web tels que Nextstrain.
Visualisation phylogénétique Nextstrain et vue cartographique des séquences génomiques du SRAS-CoV-2. (A) Arbre phylogénétique généré par le pipeline Nextstrain. Les séquences sont dérivées d’échantillons prélevés dans l’Illinois, entre avril 2020 et janvier 2021, et séquencées par notre laboratoire. Chaque couleur représente un clade Nextstrain différent. (B) Carte de l’Illinois montrant les emplacements des échantillons, par comté. La taille du cercle indique le nombre relatif de séquences dérivées de ce comté. Le diagramme à secteurs indique la distribution proportionnelle des clades Nextstrain à cet emplacement. Les couleurs de désignation de clade pour les panneaux A et B sont: 19A (bleu foncé), 19B (bleu), 20A (bleu clair), 20B (vert), 20C (jaune-vert), 20D (jaune), 20E (jaune-orange) , 20G (orange).
Par conséquent, le protocole peut fournir un moyen plus simple d’effectuer le séquençage. Les protocoles implémentent la PCR ARTIC et le nanopore MinION pour séquencer 96 échantillons à la fois.
L’équipe estime que le nouveau protocole peut fournir un point de départ fiable pour ceux qui souhaitent produire des séquences génomiques du SRAS-CoV-2 à l’aide de la technologie de séquençage des nanopores.
*Avis important
bioRxiv publie des rapports scientifiques préliminaires qui ne sont pas examinés par des pairs et, par conséquent, ne doivent pas être considérés comme concluants, orienter la pratique clinique / les comportements liés à la santé, ou traités comme des informations établies.
La source:
Référence du journal:
