Dans une récente étude publiée sur bioRxiv* serveur de préimpression, les chercheurs ont démontré l’évolution du coronavirus 2 du syndrome respiratoire aigu sévère (SRAS-CoV-2) au niveau transcriptionnel.
Sommaire
Arrière-plan
Les mutations au niveau des nucléotides (nt) dans le génome du SRAS-CoV-2 ont conduit à l’émergence d’un nouvel acide ribonucléique messager sous-génomique (ARNm sg). Le phénomène a plusieurs implications importantes, notamment pour comprendre l’émergence des variantes passées et futures du SRAS-CoV-2.
Alors que le domaine N-terminal (NTD), le lieur riche en sérine-arginine (SR) et le domaine C-terminal (CTD) de la protéine de la nucléocapside (N) du SRAS-CoV-2 se lient à l’ARN du SRAS-CoV-2, tandis que le Le domaine N3 niché à l’intérieur du C-terminal interagit avec sa protéine membranaire (M), facilitant l’empaquetage du génome en ancrant l’ARN viral aux virions naissants.
Au cours de l’évolution, deux mutations de la protéine N du SRAS-CoV-2, R203K et G204R, ont stimulé la formation d’une nouvelle séquence régulatrice de la transcription (TRS) (AGGGGAAC→AAACGAAC), qui a défini la lignée B.1.1 et ses descendants, dont trois Variantes préoccupantes (COV) du SARS-CoV-2 – Alpha (B.1.1.7), Gamma (P.1) et Omicron (B.1.1.529).
Les TRS sont nécessaires à l’expression de la pointe (S), de l’enveloppe (E), des protéines M, N et des gènes accessoires dans l’extrémité 3 ‘des génomes du coronavirus (CoV) en aval des cadres de lecture ouverts (ORF), ORF1a et ORF1b.
Lors de la transcription, la polymérase SARS-CoV-2 copie un TRS dans le corps du génome (TRS-B). Le brin d’ARN naissant se dissocie de la matrice génomique et se recuit au TRS homologue dans le leader 5 ‘(TRS-L) pour relancer la transcription donnant lieu à des ARN sg, qui sont copiés dans le sens positif, donnant de nouveaux sg ARNm. Il est à noter que cette transcription discontinue est une caractéristique de l’ordre Nidovirales.
À propos de l’étude
Dans la présente étude, les chercheurs ont infecté des cellules Vero E6 à une multiplicité élevée avec des virus de la lignée SARS-CoV-2 B, y compris B.1.1.7, B.1.351, BA.1 et B.1.1.529. Ils ont récolté les cellules VeroE6 infectées 24 heures après l’infection (hpi) et extrait leur ARN pour analyse par transcription inverse-amplification en chaîne par polymérase (RT-PCR). Le test RT-PCR a utilisé une amorce directe contre le leader 5 ‘et une amorce inverse contre l’extrémité 3’ de la protéine N.
Ensuite, ils ont confirmé la présence de l’ARNm sg Nigh ORF Three (N.iORF3) chez des humains infectés par le SRAS-CoV-2, pour lesquels ils ont analysé 12 échantillons d’écouvillons cliniques des vagues de la maladie à coronavirus 2019 (COVID-19) survenues entre fin 2020 à début 2022.
Ils ont utilisé un test RT-PCR quantitatif pour quantifier et comparer l’ARNm sg de N.iORF3 dans des échantillons humains avec d’autres espèces d’ARN viral. Les sondes couvraient la jonction d’ARNm TRS-L sg pour quantifier le nombre de copies d’ARNm N.iORF3, N et E sg.
Pour déterminer si N.iORF3 a synthétisé une protéine dans les cellules infectées, l’équipe a infecté des cellules VeroE6 de l’enzyme de conversion de l’angiotensine 2 (ACE2) – transmembrane sérine protéase 2 (TMPRSS2) avec les virus des lignées B, B.1.1, Alpha, Beta et Delta. Ils ont récolté ces cellules à 20 hpi et les ont analysées par immunotransfert.
En outre, ils ont testé l’hypothèse de savoir si la protéine N.iORF3, qui englobe le CTD de N, agit comme un antagoniste de l’interféron (IFN). Pour cela, les chercheurs ont transfecté des cellules HEK293T avec des plasmides codant N.iORF3. Après 24 heures, ils ont transfecté les cellules avec un immunostimulant polyinosinique : l’acide polycytidylique poly(I :C).
De plus, ils ont fouillé les génomes publics du SRAS-CoV-2 dans le placement complet de l’échantillon ultrarapide sur l’arbre phylogénétique de l’arbre existant (UShER). L’UShER contient la mutation R203K, G204R dans la protéine N mais pas dans les virus de la lignée B.1.1, il pourrait donc être utilisé pour déterminer si l’ARNm sg de N.iORF3 a évolué indépendamment en dehors de la lignée B.1.1.
Enfin, les chercheurs ont recherché des référentiels de séquences, tels que Nextstrain, l’initiative mondiale sur le partage des données sur la grippe aviaire (GISAID) et CoV-GLUE pour les nouveaux sites TRS-B.
Résultats de l’étude
Toutes les cellules VeroE6 infectées par le SRAS-CoV-2 avaient l’ARNm canonique de N sg pleine longueur ; cependant, un produit plus court supplémentaire correspondant à l’ARNm sg de N.iORF3 a été détecté dans les cellules infectées par Alpha et Omicron, mais pas dans les cellules infectées par les lignées B et Bêta. Les résultats de RT-PCR ont révélé que l’ARNm sg de N.iORF3 était présent dans des échantillons cliniques humains infectés par Alpha et Omicron mais pas de la lignée B.1 (Delta).
Dans les écouvillons cliniques et les cellules infectées, les auteurs ont observé que l’ARNm N.iORF3 sg et l’ARNm E sg s’exprimaient systématiquement à un niveau équivalent (30-150%) mais environ 100 fois inférieur à l’ARNm N sg.
Bien qu’en dessous de la limite de détection (102 copies), le séquençage des nanopores des produits de PCR en point final a également détecté un ARNm sg spécifique à ORF9b distinct dans les cellules infectées par Alpha. L’expression de la protéine N est restée la plupart du temps constante parmi les cellules infectées par différents variants ; de plus, il y avait une bande à ~ 25 kDa dans les cellules infectées par B.1.1 et Alpha.
Les cellules transfectées avec N.iORF3 exprimaient un IFNβ inférieur et des protéines induites par l’interféron avec l’ARNm tétratricopeptide répète 1 (IFIT1), indiquant que N.iORF3 antagonisait la signalisation IFN en aval de la détection d’ARN double brin (ds) dans le cytoplasme.
Plusieurs laboratoires déposants ont détecté l’évolution convergente de l’ARNm sg de N.iORF3, au sein du variant iota du SARS-CoV-2 (B.1.526). Fait intéressant, les auteurs ont également détecté une substitution double nt silencieuse à S202 dans toute la lignée Gamma, au moins six fois dans la lignée Alpha et même dans Omicron, indiquant une évolution ultérieure de la région N.iORF3 TRS.
Étonnamment, après N.iORF3, le site le plus fréquent était situé à la fin de ORF1ab, dans la région codant pour les protéines non structurelles (nsp) du SRAS-CoV-216.
Les auteurs ont observé au moins 21 occurrences d’évolution convergente du nsp16.iORF TRS-B, avec 82 % des séquences correspondant aux échantillons collectés lors de l’épidémie de lignée B.1.1.44 en Écosse. Une enquête plus approfondie a également confirmé que l’ARNm sg nsp16.iORF était exprimé pendant l’infection par le SRAS-CoV-2 humain.
conclusion
Les résultats de l’étude ont démontré que l’émergence de nouveaux ORF et l’évolution convergente de TRS-B sont représentatives de l’évolution du SRAS-CoV-2 et de son adaptation à de nouveaux hôtes.
Cette évolution a principalement emprunté deux voies : le transfert horizontal de gènes entre CoV et la recombinaison non homologue avec des virus non apparentés. Fait intéressant, les coronavirus dupliquent également des parties de leur génome, par exemple, dans le SRAS-CoV-2 et les virus apparentés, l’ORF3a a divergé d’une copie du gène codant pour la protéine M.
De plus, les régions 3′ d’ORF6 et ORF8 dans le SARS-CoV-2 ont une homologie de séquence significative avec le 5′UTR, ce qui suggère que TRS et ses séquences flanquantes peuvent fournir un nouveau matériel génétique. En fait, ces processus sont fondamentaux pour l’évolution des virus à ARN.
Les auteurs n’ont pas pu identifier l’ensemble complet des fonctions des protéines codées par les ARNm sg nouvellement identifiés dans le SRAS-CoV-2. Néanmoins, les résultats de l’étude ont mis en évidence les caractéristiques de l’évolution du SRAS-CoV-2 au niveau de l’ARN fonctionnel, démontrant à quel point l’évolution convergente des TRS rend difficile le suivi de l’évolution précoce du SRAS-CoV-2 chez l’homme.
À l’avenir, l’identification des modifications fonctionnellement importantes au niveau nt ainsi que des mutations d’acides aminés sera cruciale pour comprendre le cours de l’émergence de nouvelles variantes du SRAS-CoV-2.
*Avis important
bioRxiv publie des rapports scientifiques préliminaires qui ne sont pas évalués par des pairs et, par conséquent, ne doivent pas être considérés comme concluants, guider la pratique clinique/les comportements liés à la santé, ou traités comme des informations établies.
