_b5621487b90a488797de87412a21f384-620x480.jpg)
Des chercheurs de l'Université de Chicago et de la Cleveland Clinic ont présenté une nouvelle méthode de séquençage d'ARN unicellulaire qui pourrait être une application utile pour la recherche sur la pandémie actuelle de la maladie à coronavirus 2019 (COVID-19).
La technique, appelée FD-seq, est une méthode à haut débit pour le séquençage à base de gouttelettes de cellules individuelles compatibles avec le traitement au paraformaldéhyde (PFA).
Actuellement, les études de séquençage monocellulaire qui nécessitent une coloration des protéines ou une inactivation des agents pathogènes sont limitées par le fait que les méthodes à haut débit ne sont pas compatibles avec le traitement PFA, une technique largement utilisée pour la fixation des tissus / cellules.
La nouvelle technique FD-seq présentée par Savaş Tay (Université de Chicago) et ses collègues est particulièrement utile pour étudier les sous-populations rares de cellules qui nécessitent une coloration des protéines intracellulaires et un enrichissement par tri cellulaire activé par fluorescence (FACS).
Dans l'étude actuelle, l'équipe utilise FD-seq pour résoudre deux problèmes importants en virologie.
Premièrement, les chercheurs ont étudié les facteurs hôtes qui soutiennent la réactivation de l’herpèsvirus associé au sarcome de Kaposi (KSHV) dans les cellules tumorales.
Deuxièmement, ils ont utilisé FD-seq pour explorer la réponse de l'hôte dans un modèle in vitro d'infection à coronavirus OC43.
Ce coronavirus est un parent du coronavirus respiratoire aigu sévère 2 (SRAS-CoV-2), l'agent qui cause le COVID-19, indiquant ainsi l'utilisation potentielle de FD-seq pour la recherche sur la pandémie actuelle.
Une version pré-imprimée du papier est disponible sur le serveur bioRxiv *, tandis que l'article fait l'objet d'un examen par les pairs.
Sommaire
Défis rencontrés dans les études de séquençage d'ARN monocellulaire
Le séquençage d'ARN unicellulaire (scRNA-seq) a d'importantes applications à grande échelle, de la découverte de nouveaux types de cellules à la cartographie du transcriptome des cellules souches embryonnaires.
Les technologies scRNA-seq basées sur des gouttelettes sont incroyablement puissantes, en raison de leur débit élevé, qui permet l'analyse de milliers de cellules individuelles en une seule expérience.
Cependant, même avec la disponibilité de ces techniques à haut débit, l'étude des populations de cellules rares reste difficile car elle nécessite souvent un enrichissement à base de protéines de la population cellulaire.
Cet enrichissement peut parfois être réalisé à l'aide de marqueurs de surface cellulaire et FACS. Pourtant, certains types de cellules nécessitent une coloration des protéines intracellulaires, ce qui signifie souvent qu'une fixation avec du PFA est nécessaire pour augmenter le rapport signal / bruit de fond.
Cependant, la fixation de PFA présente un défi dans le séquençage de l'ARN car les acides nucléiques sont chimiquement réticulés aux protéines intracellulaires.
«Afin de récupérer de l'ARN de haute qualité à partir de cellules uniques fixées par PFA, un protocole d'inversion de liaison croisée approprié qui maintient l'intégrité de l'ARN et minimise la perte d'ARN est crucial», ont déclaré Tay et ses collègues.
FD-seq révèle des cellules de spectateurs pro-inflammatoires après une infection au coronavirus OC43. (a-b) tracés t-SNE avec des cellules colorées par (a) identité de cluster ou (b) type d'échantillon. (c) Diagramme à barres montrant le pourcentage de cellules infectées (définies comme des cellules qui ont exprimé au moins 1 transcrit viral) de l'échantillon infecté simulé et MOI 1. (d) Graphique de violon montrant la distribution du nombre total de transcriptions virales. (e) Graphique de violon montrant la distribution du pourcentage de transcription virale totale par identité de cluster. (f) Carte thermique montrant le niveau d'expression relatif de chaque gène viral de chaque cellule unique du groupe 2. La ligne bleue montre le pourcentage de chaque cellule du total des transcriptions virales. (g) Diagrammes de violon montrant l'expression de quatre gènes immunitaires représentatifs qui sont régulés à la hausse dans le groupe 0. (h) Diagramme à barres montrant les valeurs P ajustées des voies KEGG régulées à la hausse dans les groupes 1 et 2. La ligne pointillée verticale indique P- valeur = 0,05.
Qu'ont fait les chercheurs?
Maintenant, l'équipe a montré que FD-seq est une méthode à haut débit particulièrement utile pour le séquençage d'ARN à base de gouttelettes de sous-populations de cellules rares qui nécessitent une fixation de PFA.
L'équipe a utilisé la méthode pour résoudre deux problèmes difficiles en virologie.
Premièrement, ils ont étudié les facteurs de l’hôte qui influencent la réactivation de l’herpèsvirus associé au sarcome de Kaposi (KSHV) dans les cellules tumorales.
Les chercheurs disent qu'il y a un intérêt considérable à comprendre les détails moléculaires des facteurs hôtes qui modulent la latence et la réactivation du KSHV, car ils sont connus pour contribuer à la tumorigenèse virale. L'induction thérapeutique de la réactivation pourrait sensibiliser les cellules infectées de manière latente aux médicaments anti-herpèsvirus actuellement disponibles.
En utilisant FD-seq pour analyser une population rare de cellules prenant en charge la réactivation du KSHV, l'équipe a identifié quatre gènes hôtes – CDH1, CORO1C, ISCU et TMEM119 – dont les niveaux étaient fortement corrélés à la réactivation virale.
En utilisant une imagerie de cellules vivantes et une étude chronologique de l'expression des gènes viraux, les chercheurs ont découvert que le gène TMEM119 (protéine transmembranaire 119) avait l'effet le plus prononcé en termes d'induction de la réactivation du KSHV. Une analyse plus poussée par l'ARN-seq en masse a indiqué que cet effet de TMEM119 pourrait être médié par la voie de signalisation MAPK.
Application de la technique à un parent du SRAS-CoV-2
Ensuite, les chercheurs ont étudié la réponse immunitaire des cellules pulmonaires humaines à l'infection par le coronavirus OC43, un parent du SRAS-CoV-2 qui cause le rhume.
«L'OC43 a été utilisé avec succès pour découvrir des médicaments qui inhibent la réplication du SARS-CoV-2 in vitro», explique l'équipe.
Suite à l'exposition au virus, la plupart des cellules étaient incapables de supporter un niveau élevé d'expression du gène viral et ont plutôt régulé à la hausse les voies de signalisation immunitaire pro-inflammatoires impliquant des cytokines telles que l'interleukine-17 et le facteur de nécrose tumorale.
Cette découverte indique la possibilité que la libération excessive de cytokines ou «tempête de cytokines» qui a été associée à un COVID-19 sévère pourrait être provoquée par des cellules témoins et que ces cellules pourraient servir de cible thérapeutique potentielle.
«Nous avons montré une application potentielle de FD-seq pour étudier la réponse de l'hôte dans un modèle in vitro d'infection à coronavirus, ce qui suggère également son utilisation possible dans la recherche sur la pandémie COVID-19», écrit l'équipe.
Une technique utile pour les études futures
Les chercheurs concluent que FD-seq est un outil précieux pour intégrer l'activité des protéines aux informations du transcriptome.
«Les niveaux d'expression et la phosphorylation des facteurs de transcription peuvent être intégrés à l'analyse du transcriptome entier en combinant la coloration des protéines intracellulaires avec FD-seq», écrivent-ils.
En outre, « dans les études futures, FD-seq pourrait potentiellement être amélioré pour le séquençage des tissus fixés au formol et inclus en paraffine (FFPE), dont la réalisation permettrait un séquençage monocellulaire à haut débit d'échantillons facilement disponibles dans les banques de tissus », conclut l'équipe.
*Avis important
bioRxiv publie des rapports scientifiques préliminaires qui ne sont pas examinés par des pairs et, par conséquent, ne doivent pas être considérés comme concluants, orienter la pratique clinique / les comportements liés à la santé, ou traités comme des informations établies.
