Dans une étude menée à l’Institut israélien de technologie (Technion), Israël, des scientifiques ont développé et validé un test de fluorescence sans cellules pour le dépistage rapide des inhibiteurs de protéines. Ils se sont principalement concentrés sur les inhibiteurs candidats qui bloquent l’interaction entre le domaine de liaison au récepteur de pointe (RBD) du coronavirus 2 du syndrome respiratoire aigu sévère (SRAS-CoV-2) et l’enzyme humaine de conversion de l’angiotensine 2 (hACE2).
Étude : Un test sans cellule pour le dépistage rapide des inhibiteurs du récepteur hACE2 – liaison SARS-CoV-2-Spike. Crédit d’image : Dana.S/Shutterstock
Une version préimprimée de l’étude est disponible sur le site bioRxiv* serveur pendant que l’article est soumis à une évaluation par les pairs.
Sommaire
Fond
Le SRAS-CoV-2, l’agent pathogène responsable de la maladie à coronavirus 2019 (COVID-19), est un virus à ARN enveloppé, simple brin et de sens positif qui attaque principalement les cellules épithéliales exprimant l’ACE2 des voies respiratoires humaines. L’entrée de la cellule hôte virale est médiée par l’interaction entre le récepteur membranaire de la cellule hôte ACE2 et le pic viral RBD, suivie de la fusion de l’enveloppe virale avec la membrane cellulaire hôte. Ainsi, les inhibiteurs de petites molécules qui bloquent cette interaction peuvent servir d’agents thérapeutiques potentiels pour prévenir l’infection par le SRAS-CoV-2.
Dans la présente étude, les scientifiques ont développé un test de fluorescence acellulaire qui peut être utilisé pour cribler les inhibiteurs candidats de l’interaction ACE2 – RBD.
Le dosage
L’essai comprend des particules de polystyrène fluorescentes revêtues de RBD qui capturent hACE2 marqué par fluorescence en l’absence d’un inhibiteur. Lorsqu’il est incubé avec un inhibiteur, aucune interaction ne se produit entre le RBD et l’ACE2. Cela se traduit par la réduction des signaux fluorescents qui peuvent être détectés par cytométrie en flux ou microscopie à fluorescence. Les scientifiques ont enduit de manière covalente des particules fluorescentes de RBD pour générer des particules de type virion.
Validation du dosage
Les scientifiques ont mené in vitro expériences pour valider la spécificité des particules recouvertes de RBD (particules de virion) se liant à hACE2. Les résultats ont révélé que les particules de type virion se lient spécifiquement à hACE2 et non à l’étiquette fluorescente (mCherry) utilisée dans l’étude.
Les expériences qu’ils ont menées pour déterminer la sensibilité et la durée du test ont révélé que les particules de type virion ont une sensibilité élevée même pour une petite quantité de hACE2. Cependant, une concentration plus élevée de hACE2 a fourni une plus grande sensibilité pour les particules de type virion. De plus, ils ont estimé que le temps de réaction optimal pour la liaison RBD – ACE2 est de 45 minutes.
Le signal fluorescent qu’ils ont obtenu dans le test était un signal bimodal ou numérique. Il n’y avait pas de décalage analogique des particules de type virion des valeurs de non-fluorescence aux valeurs de pleine fluorescence. Cela indique une liaison coopérative entre les particules de type virion et hACE2. Comme suggéré par les scientifiques, cette coopérativité pourrait être due à des changements de conformation inbound hACE2 qui provoquent une interaction plus forte avec d’autres molécules hACE2.
Ils ont validé la fonctionnalité du test en effectuant la réaction de liaison en présence et en l’absence d’un peptide synthétique anti-RBD. Les résultats ont montré une réduction dose-dépendante continue de la liaison RBD – hACE2 en présence de l’inhibiteur synthétique. Cela indique que le test peut être utilisé pour analyser quantitativement l’inhibition de RBD – hACE2.
Interaction entre particules virales et ARN – granules de protéines
Dans une autre série d’expériences, les scientifiques ont exploré l’affinité de liaison des particules de type virion pour l’ARN synthétique – des granules de protéines qui devraient réduire la quantité de particules virales actives. La partie ARN des granules était composée d’ARN synthétique long non codant et la partie protéique était composée de hACE2. Ces granulés ont été produits in vitro par auto-assemblage.
Mécaniquement, le long ARN non codant contient plusieurs sites de liaison pour hACE2 et augmente ainsi la concentration locale de hACE2. Ceci, à son tour, facilite le piégeage des particules virales, mettant en évidence le potentiel des granules de protéines ARN en tant qu’agents thérapeutiques anti-SARS-CoV-2.
Les résultats du test ont révélé que les particules de type virion se lient aux granules d’ARN recouverts de hACE2 avec une sélectivité et une spécificité élevées. Cette découverte confirme l’activité anti-SARS-CoV-2 des granules ARN-protéines.
Importance de l’étude
Le test de fluorescence sans cellules développé dans l’étude peut être utilisé pour dépister rapidement et de manière rentable les inhibiteurs d’entrée du SRAS-CoV-2 sans nécessiter de configuration de laboratoire de haut niveau de biosécurité. L’application du test pourrait être étendue pour évaluer les interactions entre les mutants RBD et hACE2 ou d’autres récepteurs de cellules hôtes.
*Avis important
bioRxiv publie des rapports scientifiques préliminaires qui ne sont pas évalués par des pairs et, par conséquent, ne doivent pas être considérés comme concluants, orienter la pratique clinique/le comportement lié à la santé, ou traités comme des informations établies.
