Dans une étude récente publiée dans la revue Biotechnologie naturelleles chercheurs décrivent le système régulateur de pA basé sur un commutateur basé sur l’acide ribonucléique (ARN) pour réguler l’expression des gènes des mammifères en modulant le clivage d’un signal polyA synthétique (PAS) au niveau d’une région non traduite 5′ transgénique (UTR).
Étude: Contrôlez l’expression des gènes des mammifères en modulant le clivage du signal polyA en 5′ UTR. Crédit d’image : MMD créatif/Shutterstock.com
Sommaire
Approches actuelles de la thérapie génique
Le contrôle génétique dans les cellules de mammifères est essentiel au développement de traitements géniques sûrs et efficaces. Les méthodes actuelles sont associées à certains inconvénients, tels que des réponses immunologiques indésirables, une efficacité limitée et une surexpression de gènes thérapeutiques.
Les technologies actuelles de transfert de gènes, telles que les virus adéno-associés (AAV), ont du mal à effectuer un contrôle génétique conditionnel et réversible. Les ligands toxiques, les fuites et les concentrations élevées de ligands, ainsi que la petite plage dynamique sont quelques-unes des limitations associées aux systèmes actuels basés sur l’ARN.
À propos de l’étude
Des tests de luciférase ont été effectués dans des cellules de mammifères, suivis d’une extraction d’ARN de cellules transfectées pour une analyse par réaction en chaîne par polymérase par transcription inverse (RT-PCR). Les chercheurs ont imagé des lignées cellulaires stables par microscopie à fluorescence et les ont analysées par cytométrie en flux.
Le vecteur AAV a été créé, suivi d’expériences d’expression de luciférase contrôlées par le régulateur pA chez la souris et in vivo imagerie bioluminescente. De plus, l’insertion du régulateur pA a été réalisée par des répétitions palindromiques regroupées régulièrement espacées (CRISPR) associées à la protéine 9 (Cas9) et au tri cellulaire activé par fluorescence (FACS) du groupe de clones unicellulaires de différenciation 133 (CD133) contrôlé par le régulateur.
Les chercheurs ont découvert des moyens d’incorporer un PAS artificiel dans des aptamères structurés, qui conservaient son activité, même lorsqu’ils étaient incorporés dans des aptamères structurés. Le PAS synthétique a été géré en se liant au Tc, un médicament oral approuvé par la Food and Drug Administration (FDA) des États-Unis. Un PAS synthétique a été ajouté dans les régions où la séquence de l’aptamère cb32 nécessitait une légère substitution pour former la séquence PAS «AAUAAA» ou dans la région simple brin.
Deux motifs améliorant la polyadénylation ont été introduits dans la fonction PAS synthétique. L’activité luciférase dans les cellules HEK-293T a été mesurée pour déterminer l’efficacité de clivage du PAS synthétisé.
A6 a été choisi comme base pour la construction du commutateur biologique régulé par Tc en raison de son efficacité de clivage apparemment élevée. L’« induction en pli » a été calculée sur la base de la proportion de signaux de luciférase en présence ou en absence de Tc afin d’évaluer l’expression induite par Tc. Au total, plus de 180 constructions ont été créées pour évaluer systématiquement les impacts de divers éléments de la structure en forme de Y afin d’améliorer la configuration de Y16.
Une méthode d’épissage alternative médiée par le « G-quad » et inductible par un médicament a été développée pour gérer le PAS synthétique afin d’atteindre une sensibilité et une plage dynamique accrues. Plusieurs séquences ajoutant un potentiel 3 ‘SS ‘AG’ en aval du MAZ G-quad ont également été évaluées.
Des courbes dose-réponse ont été générées en utilisant Y362 et Y387 comme exemples pour définir la plage régulable complète des régulateurs pA. Le régulateur pA a été évalué chez des souris vivantes en utilisant un vecteur AAV2/9 codant pour Y387 et le gène de la luciférase. À cette fin, des souris ont reçu une injection intrapéritonéale de différentes doses de Tc pour évaluer la in vivo réponse du régulateur Y387 pA.
Résultats de l’étude
Le régulateur switch pA basé sur l’ARN constitue une approche unique pour réguler l’expression de gènes de mammifères en modulant le clivage du PAS. Un double mécanisme régule le clivage déclenché par la liaison du médicament et comprend la fixation de l’aptamère pour limiter le clivage du PAS et un épissage alternatif provoqué par le médicament pour éliminer le PAS.
De plus, cette technique évite les réactions immunologiques associées à d’autres systèmes. En conséquence, une induction de 900 fois est obtenue avec une concentration efficace à moitié maximale (EC50) de 0,50 g/ml de tétracycline (Tc), ce qui se situe dans la plage posologique autorisée par la FDA américaine.
Le régulateur pourrait contrôler les transgènes de la luciférase chez la souris et l’expression du CD133 par les tissus humains de manière réversible et dépendante de la dose, garantissant ainsi une stabilité à long terme. Le système pA a permis la génération de n’importe quelle protéine intacte en tant que produit transgénique sans modifier sa séquence codante, évitant ainsi les réponses immunitaires spécifiques au transgène qui ont été observées dans d’autres systèmes. De plus, le système avait une plage de régulation de 900 fois tout en réduisant les expressions de fuite de base à 0,10 %.
Les aptamères se liant au Tc peuvent influencer l’expression des gènes en modulant le clivage du PAS. La méthode impliquait l’insertion d’un signal polyA synthétique dans un 5′ UTR, ce qui provoquait un clivage moléculaire efficace de l’ARN messager (ARNm). Un ligand de type petite molécule a bloqué le clivage en se liant aux séquences d’aptamères d’ARN, conservant ainsi l’ARNm intact et induisant l’expression transgénique.
La structure en forme de Y des aptamères pourrait inhiber l’activité du PAS, alors que la liaison du Tc l’améliore au niveau du G-quad. Cela conduirait à un épissage alternatif 3 ‘SS en aval.
Le PAS et l’épissage alternatif étaient fortement liés, et le régulateur pA régulait efficacement les transgènes comme la protéine fluorescente verte améliorée (eGFP). Ce système s’est avéré efficace dans plusieurs lignées cellulaires de mammifères et est compatible avec les cellules et les promoteurs. La cytométrie en flux a montré la reconnaissance du Tc par l’ensemble de la population cellulaire, ce qui en fait un motif « portable ».
Conclusions
Les résultats de l’étude mettent en évidence le système régulateur pA, un commutateur basé sur l’ARN qui régule l’expression des gènes en ajustant le clivage du signal polyA synthétique dans un 5′ UTR transgénique. Cette technique diffère des systèmes riboswitch traditionnels, car le PAS est présent dans le 5 ‘UTR, combine les effets de nombreux aptamères et utilise deux processus de liaison au Tc et d’épissage alternatif. Cependant, le nouveau système ne peut utiliser que le Tc comme ligand inducteur, qui ne peut pas pénétrer efficacement dans tous les tissus corporels.
