Une entrevue avec Fred Kielhorn, PDG de DeNovix, menée par Jake Wilkinson, MChem
Sommaire
Quel impact la capacité de mesurer des volumes de microlitres d’échantillons via la spectrophotométrie US-Vis a-t-elle eu sur la recherche en sciences de la vie ?
Avant la spectrophotométrie microvolume, la quantification UV-Vis des biomolécules a été réalisée à l’aide de cuvettes en quartz avec une longueur de trajet de 10 mm. Les cuvettes présentaient un certain nombre de limitations clés qui les rendaient inadaptées aux exigences des techniques des sciences de la vie alors émergentes telles que les microréseaux.
Les cuvettes nécessitaient de grands volumes d’échantillon, nécessitaient un nettoyage entre chaque échantillon et avaient une plage de concentration limitée sur laquelle elles pouvaient quantifier avec précision.
Le développement de la spectrophotométrie microvolume a éliminé la cuvette de la quantification UV-Vis en utilisant une goutte d’échantillon pour combler un espace entre deux surfaces de mesure.
Crédit image : DeNovix
La lumière passe directement à travers l’échantillon et la longueur du trajet est définie par la distance entre les surfaces, plutôt que par les dimensions d’une cuvette.
L’élimination des cuvettes présentait des avantages cruciaux dans les sciences de la vie. Tout d’abord, il a permis aux scientifiques de quantifier de très petits volumes d’échantillons, généralement un microlitre. La génomique évoluait alors, comme aujourd’hui, vers des volumes plus petits et des concentrations plus faibles à mesure que la complexité des échantillons était réduite.
Avant l’analyse en microvolume, les échantillons ont été dilués dans de grands volumes de tampon et mesurés à l’aide de cuvettes. Les méthodes de microvolume ont supprimé l’exigence de dilution en dosant directement l’échantillon.
En utilisant des trajets optiques extrêmement courts, les spectrophotomètres à microvolume peuvent mesurer sur une large plage dynamique. Cela a amélioré la précision des mesures et fait gagner du temps et un précieux échantillon.
La technique a-t-elle permis d’entreprendre de nouvelles expériences, qui n’étaient pas possibles auparavant ?
La quantification des microvolumes est devenue un élément essentiel du flux de travail pour de nombreuses techniques de pointe dans la recherche en sciences de la vie.
Des applications telles que le séquençage de nouvelle génération et les puces à ADN reposent sur une quantification précise des échantillons avant et pendant l’analyse en tant qu’aspect clé du contrôle de la qualité et de la nécessité de passer à l’étape suivante du flux de travail.
Les applications de protéines ont été initialement plus lentes à adopter cette technologie. Les premiers instruments sur le marché étiraient une colonne d’échantillons entre des socles d’échantillons et la tension superficielle plus faible des tampons protéiques entraînait parfois des colonnes brisées et des résultats inexacts.
Cela a conduit à un scepticisme quant à la pertinence des microvolumes UV-Vis pour les mesures de protéines. Ceci est surmonté dans la série DeNovix DS-11 car l’échantillon est compressé à la longueur de trajet optimale et jamais étiré.
Cela a conduit de nombreux laboratoires de protéines et d’anticorps à adopter la technologie pour la première fois et a permis des applications telles que la quantification rapide de formulations de protéines thérapeutiques à haute concentration.
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Quelle est la meilleure pratique pour préparer et livrer un échantillon spectrophotométrique ?
L’un des avantages de la spectrophotométrie microvolume DeNovix est que l’instrumentation et le logiciel sont simples et rapides à utiliser, mais certains aspects importants des meilleures pratiques doivent être pris en compte.
- Assurez-vous que les méthodes de préparation des échantillons sont optimisées et que les échantillons sont purifiés avant la mesure. Tous les acides nucléiques présentent un pic d’absorbance à ou autour de 260 nm.
La présence d’ADN fragmenté, d’oligos ou d’ARN dans l’échantillon d’ADN génomique, par exemple, contribuera à l’absorbance totale à 260 nm et conduira à une surestimation de la concentration de l’échantillon.
- Évitez les tampons qui absorbent fortement à la même longueur d’onde que votre échantillon. Si des contaminants sont présents et inévitables, des instruments tels que le DeNovix DS-11 FX permettent également d’utiliser des méthodes fluorimétriques qui quantifieront spécifiquement la molécule d’intérêt. La combinaison des méthodes fluorométriques et d’absorbance donne une image quantitative et qualitative complète d’un échantillon.
- S’assurer que les surfaces de mesure supérieure et inférieure sont propres avant de charger des blancs ou des échantillons est important pour fournir des résultats précis. Effectuer un blanc sur une surface de mesure sale peut conduire à des résultats anormaux, par exemple des spectres négatifs.
- La livraison d’échantillons est simple en spectrophotométrie microvolume, mais certaines pratiques exemplaires peuvent être appliquées pour garantir des résultats de haute qualité. L’aliquotage de petits volumes d’échantillons non homogènes peut être une source de variabilité des données. Par conséquent, avant le chargement, les échantillons doivent être soigneusement décongelés et vortexés pour s’assurer qu’ils sont bien mélangés.
Les échantillons doivent ensuite être chargés avec une pipette de taille appropriée et un nouvel embout pour chaque aliquote. Si des répliques sont testées, une aliquote fraîche doit être utilisée pour chaque mesure.
Série DS 11 | Spectrophotomètre | Fluoromètre
N’importe quel tampon peut-il être utilisé pour les mesures spectrophotométriques ou faut-il des tampons spécialisés ?
Il n’y a aucune exigence de tampons spécialisés pour l’utilisation de la spectrophotométrie microvolume, mais les tampons à forte absorbance à la longueur d’onde d’intérêt doivent être évités. Il est également conseillé d’éviter les tampons très volatils.
Quels autres paramètres sont importants et comment peuvent-ils être contrôlés pour garantir des résultats précis ?
Afin d’obtenir des résultats quantitatifs à partir des mesures d’absorbance, l’équation de Beer-Lambert est utilisée. Cela corrèle l’absorbance avec la concentration de l’échantillon, son coefficient d’absorption molaire et la distance parcourue par la lumière à travers l’échantillon – la longueur du trajet.
A=ε*b*c
- UN: valeur d’absorbance
- ε: coefficient d’absorptivité avec des unités de L /mol * cm
- b: trajet optique de l’échantillon exprimé en cm.
- c: concentration de l’échantillon en solution, exprimée en mol/L.
La précision de la quantification est donc intrinsèquement liée à la précision avec laquelle le trajet optique peut être réglé. Dans les systèmes à cuvette, cette distance est définie par les dimensions de la cuvette et est généralement de 10 mm.
Les systèmes à microvolume utilisent diverses méthodes pour régler cette distance. Souvent, les vis de réglage sont utilisées pour définir une ou deux longueurs de trajet entre lesquelles l’utilisateur ou le logiciel bascule.
Chez DeNovix, notre système de mesure inclut la technologie SmartPath®. SmartPath nous permet de contrôler avec précision la distance entre les deux surfaces de mesure à moins d’un micron et d’utiliser le retour d’absorbance en temps réel pour fournir la longueur de trajet optimale pour chaque échantillon.
Comment la technologie SmartPath de DeNovix garantit-elle que la longueur du trajet est correcte ?
Le DS-11 utilise un système opto-mécanique breveté avec des algorithmes propriétaires qui contrôlent ensemble la longueur du trajet. SmartPath utilise une vis de réglage optique de précision ainsi qu’un encodeur haute résolution qui offre un contrôle précis et fiable de la longueur du trajet optique.
DeNovix DS-11 | Spectrophotomètre | Spectrophotométrie UV-Vis
La relation entre la rotation et la longueur du trajet est bien caractérisée et immuable, ce qui permet de définir la longueur du trajet en toute confiance sans nécessiter de réétalonnage ou de maintenance de routine.
Le DS-11 utilise des données d’absorbance en temps réel pour déterminer la longueur de trajet optique optimale pour chaque échantillon, réduisant automatiquement la distance entre les surfaces de mesure pour fournir des résultats précis.
Les échantillons à concentration plus élevée nécessitent des longueurs de trajet de plus en plus courtes et le contrôle précis que DeNovix a sur le chemin optique nous permet de définir avec précision des longueurs de trajet extrêmement petites de manière fiable et reproductible sans nécessiter d’étalonnage.
Les spectrophotomètres à microvolume nécessitent-ils des contrôles d’étalonnage de routine ?
Une longueur de trajet mal calibrée est une erreur systématique potentielle pour certains systèmes de microvolume. Un écart de longueur de trajet par rapport à la valeur calibrée entraînera une erreur constante dans chaque échantillon mesuré.
De nombreux instruments sur ce marché exigent que l’utilisateur ou un ingénieur de service valide l’étalonnage à intervalles réguliers. Si l’instrument échoue à un contrôle d’étalonnage, l’utilisateur engage le coût d’un ingénieur de service pour le recalibrer, fait face à des temps d’arrêt de l’instrument et les données collectées entre les étalonnages peuvent être remises en question.
La technologie SmartPath offre à l’utilisateur la certitude que chaque longueur de trajet est déterminée avec précision, à chaque fois. La série DS-11 ne nécessite aucun entretien de routine ou contrôle d’étalonnage, ce qui réduit le coût de possession et donne l’assurance que des résultats précis et reproductibles seront toujours obtenus.
Quels spectrophotomètres DeNovix fournit-il pour les mesures en microlitres ?
La série DS-11 de spectrophotomètres/fluoromètres combine trois modes de mesure. L’UV-Vis microvolume est présent dans toute la gamme et le client peut choisir parmi des modèles qui intègrent cela avec l’UV-Vis et/ou la fluorescence à base de cuvette.
Démo sur demande | Spectrophotomètre | Fluoromètre
Chaque mode dispose d’une source lumineuse optimisée et d’un chemin optique spécifique à l’application, garantissant aucun compromis sur les performances.
Crédit image : DeNovix
Pour ceux qui n’ont besoin que de la fluorescence, notre fluorimètre QFX intègre toutes les fonctionnalités logicielles et de mise en réseau de la gamme DS-11, mais sans absorbance.
Quelles caractéristiques du spectrophotomètre DS-11 le rendent idéal pour effectuer des mesures en microlitres ?
La caractéristique clé que les clients nous disent toujours et qui détermine leur décision d’acheter le DS-11 est l’exactitude et la précision avec lesquelles il fournit des données. Le DS-11 est le spectrophotomètre à microvolume le plus sensible et mesure la plage de concentration la plus large. C’est également le seul instrument à combiner l’absorbance et la fluorescence en microvolume réel.
Tous nos instruments disposent d’un grand écran tactile compatible avec les gants et exécutent notre logiciel unique EasyApps®, conçu et développé en interne chez DeNovix. Le DS-11 s’intègre parfaitement aux réseaux Wi-Fi ou câblés et permet l’exportation de données par e-mail, lecteurs réseau, imprimantes réseau, imprimantes d’étiquettes, systèmes LIMS ou clés USB.
Où nos lecteurs peuvent-ils en savoir plus sur la réalisation de spectromètres au microlitre plus précis ?
Des notes techniques et des livres blancs sont disponibles sur www.denovix.com. DeNovix gère également un programme d’essai gratuit en laboratoire et un programme d’échange.
À propos de Fred Kielhorn
M. Kielhorn a débuté sa carrière en 1988 chez DuPont et a occupé des postes en R&D en catalyse, en développement de procédés, en logistique et en développement de marché sur une période de 15 ans. En 2000, il a eu l’opportunité de co-fonder NanoDrop Technologies Inc. avec Charles Robertson, Patricia Robertson et Lynne Kielhorn.
Pendant son mandat de président de NanoDrop, la société a développé et lancé trois produits à succès pour la recherche en sciences de la vie. En 2007, NanoDrop a été acquis par Thermo Fisher Scientific et il a ensuite formé la société de capital-risque, Kielvest LLC.
Pendant plusieurs années, Kielvest a réalisé de nombreux investissements dans la technologie de démarrage. En 2012, Kielhorn a fondé DeNovix Inc. et est le PDG de l’entreprise. Fred est titulaire d’un BS en génie chimique de l’Université du Missouri-Rolla (maintenant connue sous le nom d’Université des sciences et technologies du Missouri).
