Amorce N unique suffisante pour le diagnostic moléculaire du SRAS-CoV-2

Il existe une demande énorme et croissante de tests de diagnostic moléculaire meilleurs et plus rentables pour le COVID-19, car la pandémie montre peu de signes de maîtrise dans un avenir proche.

Le test le plus couramment utilisé est la réaction en chaîne transcriptase-polymérase inverse (RT PCR), qui utilise un ou plusieurs gènes cibles. Une nouvelle étude publiée dans le preprint medRxiv * serveur en décembre 2020 discute de l’utilité d’utiliser différents ensembles d’amorces ciblant différentes régions de la cible du gène N.

Comparaison entre les valeurs N1 et N2 Ct lors de la détection du SARS-CoV-2 dans des échantillons de patients. Crédit d’image: https://www.medrxiv.org/content/10.1101/2020.12.06.20244905v1.full.pdf

Le kit CDC utilise un ensemble double sonde-apprêt

Des études antérieures ont montré des résultats différents de l’utilisation de diverses sondes et amorces. Les kits de diagnostic des Centers for Disease Control and Prevention (CDC) des États-Unis ciblent l’antigène N et utilisent deux ensembles d’amorces à haute sensibilité pour le coronavirus 2 du syndrome respiratoire aigu sévère (SARS-CoV-2).

Plusieurs tests n’utilisent qu’un seul ensemble d’amorces pour la détection du SRAS-CoV-2, mais il n’y a aucune preuve réelle pour ou contre cette pratique, contrairement à l’utilisation de cibler différentes régions du génome du virus.

La justification de l’utilisation de cibles multiples est la fréquence élevée d’altération du génome viral qui peut rendre l’amorce moins capable de détection virale. Cependant, cette pratique a fait monter le niveau de la technologie et le coût du test. Les chercheurs n’ont détecté aucune mutation dans les régions cibles du gène N, dans des génomes collectés en Amérique du Sud.

Le présent article décrit les résultats en utilisant l’un des deux antigènes commerciaux N du panel de test CDC, qui est considéré comme l’un des plus sensibles et spécifiques au monde.

Détails de l’étude

Les chercheurs ont utilisé plus de 1000 échantillons d’écouvillons et d’expectorations nasopharyngés, nasaux et oropharyngés, collectés en mai et juin 2020, tous des échantillons résiduels utilisés pour la détection du SRAS-CoV-2 dans le laboratoire des vecteurs et des maladies infectieuses. Ils ont constaté que les valeurs de seuil de cycle (Ct) étaient similaires pour tous les échantillons avec des ensembles d’amorces N1 ou N2.

Ils ont évalué quantitativement les fréquences des résultats entre les ensembles d’amorces N1 et N2, pour arriver à l’adéquation de chaque plage de valeurs Ct. Ils ont découvert que l’un ou l’autre des ensembles était capable de détecter l’ARN viral avec la même valeur Ct. Cela concorde avec les études antérieures sur les performances des ensembles d’amorces-sondes de plusieurs kits de diagnostic.

Cela suggère qu’un seul jeu d’amorces pourrait être utilisé pour tester les patients atteints de cette infection. Cela pourrait réduire les coûts de test tout en maintenant la précision et l’efficacité du diagnostic. Certaines études ont même conclu que la salive pouvait être utilisée pour le diagnostic sans perte de sensibilité pour la détection virale du COVID-19.

Précision de la cible

Les chercheurs ont également tenté de déterminer si les seuils de valeur Ct étaient appropriés. En utilisant des modèles de gène N disponibles dans le commerce, ils ont mesuré les limites de détection (LoD) et les seuils pour chaque jeu d’amorces. Ils ont découvert que l’un ou l’autre était capable de détecter 5 copies du génome par microlitre de réaction. La valeur Ct était ~ 34 pour N1 ou N2.

De nombreuses études de modélisation suggèrent que le test CDC utilise un seuil de Ct élevé, avec des protocoles standard qui recommandent un Ct de 40. L’étude actuelle montre que l’une ou l’autre des amorces donne lieu à une amplification non spécifique, peut-être en raison de l’hybridation des amorces dans différentes régions de l’homme. génome.

Les chercheurs suggèrent l’utilisation de la technique PCR conventionnelle avec du gel d’acrylamide dans des endroits éloignés où le diagnostic moléculaire peut être difficile d’accès.

Les chercheurs ont également évalué des échantillons d’un seul patient, recueillis 2 à 6 jours après le premier. Seul un tiers environ était négatif, un autre tiers avait une valeur Ct réduite et le reste était positif à la même valeur Ct. Pour les échantillons doublement positifs avec un Ct> 33, le test avait une faible sensibilité et spécificité.

Ainsi, les échantillons testés avec un Ct proche de la LoD sont peu prédictifs d’un vrai résultat positif. Au lieu d’utiliser ces échantillons pour le diagnostic, de nouveaux échantillons doivent être obtenus pour un deuxième test de confirmation.

Valeur prédictive médiocre à un Ct plus élevé

Une étude antérieure a montré que la valeur Ct augmentait au cours de l’intervalle de 21 jours entre les tests successifs. Les valeurs supérieures à 40 sont parfois recommandées pour être écartées dans un test de diagnostic pour ce coronavirus. L’étude actuelle et d’autres études antérieures montrent que la valeur prédictive du test RT PCR diminue significativement lorsque le Ct est supérieur à 35, en utilisant le protocole CDC.

Les patients de l’étude en cours dont les échantillons étaient positifs avec un Ct supérieur à 33 avaient des résultats de test très différents lorsque les tests étaient répétés en 2 à 6 jours. Ainsi, à des valeurs Ct élevées, les tests positifs peuvent avoir une faible valeur prédictive. En d’autres termes, les échantillons testés positifs à des valeurs Ct élevées sont peu reproductibles.

Les raisons peuvent en être la contamination croisée des échantillons, une faible charge virale due à la phase tardive ou très précoce de l’infection et une faible charge virale près de la LD de la méthode de test utilisée. Dans de tels cas, un nouvel échantillon doit être obtenu et testé pour un diagnostic fiable.

Aperçu de la réinfection vraie ou fausse

Plusieurs cas de réinfection ont été rapportés, dans certains desquels la personne a d’abord eu un cas d’infection légère par le SRAS-CoV-2 avec une faible charge virale et un test positif avec une valeur Ct élevée. Vient ensuite une période sans séroconversion, après laquelle une seconde infection est signalée, cette fois avec une charge virale élevée et des symptômes sévères. À ce stade, le patient séroconvertit.

L’une des meilleures études sur l’immunité humorale dans l’infection par le SRAS-CoV-2 a montré que les anticorps neutralisants sont produits de manière robuste et durable après une seule infection. Compte tenu de ces résultats, les auteurs du présent article suggèrent que si des valeurs Ct élevées sont signalées au moment du diagnostic initial ou du deuxième diagnostic dans de tels cas, un verdict de réinfection devrait être retenu.

Pour confirmer ce diagnostic de réinfection, les deux épisodes doivent avoir des antécédents de charge virale claire et aucune preuve de contamination croisée des échantillons pendant le traitement, ce qui expliquerait à la fois les valeurs élevées de Ct et les différences dans les gènes cibles. Ce n’est que si la charge virale dans les deux épisodes correspond à une valeur Ct inférieure à 30 qu’elle doit être considérée comme un cas de réinfection, disent-ils.

Quelles sont les conclusions?

L’étude actuelle montre ainsi que des ensembles d’amorces et de sondes N1 ou N2 peuvent être utilisés individuellement pour diagnostiquer cette infection. Cependant, avec le kit de test CDC, la sensibilité et la spécificité chutent considérablement lorsque les valeurs Ct sont proches de la LoD de chaque laboratoire. Ainsi, le protocole CDC RT PCR doit être utilisé avec précaution dans de tels cas.

Au lieu de cela, dans de tels échantillons, si le Ct est au-dessus de la LoD, l’ARN doit être ré-extrait et un autre protocole utilisé. En cas de doute, un nouvel échantillon doit être prélevé avant d’arriver à un diagnostic positif. Ainsi, cette étude pourrait affecter l’interprétation des futurs résultats des tests COVID-19 ainsi que les méthodes d’analyse d’échantillons par PCR ciblant le gène N.

*Avis important

medRxiv publie des rapports scientifiques préliminaires qui ne sont pas évalués par des pairs et, par conséquent, ne doivent pas être considérés comme concluants, orienter la pratique clinique / les comportements liés à la santé ou être traités comme des informations établies.