Le phénotypage inverse montre des profils de lymphocytes T réactifs dans l’infection par le SRAS-CoV-2

La nature et les déterminants de l’immunité à la suite d’une infection par le coronavirus 2 du syndrome respiratoire aigu sévère (SRAS-CoV-2) suscitent beaucoup d’intérêt. Il est connu qu’une immunité spécifique adaptative est rapidement déclenchée lors d’une exposition au virus, impliquant à la fois des cellules T et des cellules B productrices d’anticorps.

Une nouvelle étude apparaissant en pré-impression sur le medRxiv * navigateur en décembre 2020 utilise la technologie de phénotypage inversé pour explorer les réponses des cellules T dans COVID-19.

Convergence phénotypique des cellules T réactives stimulées in vitro du sang périphérique et des cellules T in vivo des voies respiratoires de patients gravement malades. Crédit d’image: https://www.medrxiv.org/content/10.1101/2020.12.07.20245274v1.full.pdf

Problèmes avec les tentatives de phénotypage des cellules T

La vitesse sans précédent de la recherche a conduit à l’identification des antigènes immunodominants du SARS-CoV-2 et des lymphocytes T correspondants réactifs aux antigènes. À partir de maintenant, les méthodes utilisées pour spécifier le degré d’activation et de différenciation des cellules T sont variées, ce qui conduit à une confusion sur de nombreux aspects phénotypiques. Certains ont, par exemple, rapporté les phénotypes des cellules T activées seules, sans caractérisation de base des cellules T inactivées dans la même situation. Dans d’autres études, la spécificité des antigènes associés aux profils d’activation caractérisés par les chercheurs reste non vérifiée.

Les défis du phénotypage uniquement des cellules T activées qui ont réagi à des antigènes spécifiques incluent le fait que ces cellules réactives aux antigènes ont été restimulées avec des antigènes du SRAS-CoV-2 in vitro. Ce n’est qu’ainsi que de telles cellules peuvent être détectées. Ceci est suivi par l’identification de marqueurs de surface activés à la hausse, tels que CD154, ou de cytokines d’activation telles que le marqueur d’activation bien connu IFNy.

Cependant, le processus de restimulation entraîne automatiquement des changements majeurs dans le phénotype. Ceci est dû au fait in vitro l’activation des cellules T est associée à un profil d’expression distinctif par rapport aux cellules T non perturbées, ici appelées in vivo Cellules T.

Multimères pHLA – et leurs limites

L’un des outils utilisés ici pour éviter de telles différences inutiles est l’utilisation de multimères d’antigène leucocytaire humain peptidique (pHLA) spécifiquement conçus, qui peuvent être retirés pour laisser les cellules T réactives à l’antigène non perturbées pour le phénotypage.

Ces multimères ne peuvent être développés que si l’épitope spécifique est correctement défini en premier, et chacun correspond à un seul haplotype HLA. Les cellules T CD4 HLA de classe II sont difficiles à purifier avec cette technologie, ce qui présente un obstacle au profilage phénotypique des cellules T réactives aux antigènes sans changements significatifs dus à la restimulation in vitro.

Données d’activation des cellules T sans discernement

De nombreux chercheurs ont utilisé les données de l’atlas des gènes immunophénotypiques trouvés dans l’Initiative de l’Atlas des cellules humaines. Cependant, cela contient une multitude de phénotypes différents provenant de différents états pathologiques et de divers sites tissulaires.

Encore une fois, les cellules T réactives aux antigènes auront des états d’activation différents en fonction de leur emplacement dans le corps, car tous ne sont pas exposés à l’agent infectieux. Même dans le COVID-19, on peut s’attendre à ce que les lymphocytes T du poumon ou des voies respiratoires supérieures soient plus actifs que ceux de la circulation, car ces derniers ne sont pas exposés aux antigènes viraux.

Séquençage d’ARN à cellule unique

Ce qui est requis pour in vivo le phénotypage des lymphocytes T activés est constitué de données cliniques et d’un profilage profond des lymphocytes T exposés à des antigènes spécifiques, à travers différents tissus, en même temps, provenant du même patient.

À cette fin, les chercheurs actuels ont utilisé le séquençage d’ARN unicellulaire pour examiner les modèles de transcription des cellules T dans tout le corps, ainsi que pour définir les séquences des récepteurs des cellules T (TCR), en même temps. Cette technique est capable de générer des phénotypes de lymphocytes T réactifs aux antigènes en état d’activation.

Phénotypage inversé

Les chercheurs ont d’abord isolé les cellules T de différents tissus et, pour chaque échantillon, ils les ont divisés en différents groupes. Chaque groupe représente les cellules T qui réagissent à un anticorps spécifique commun et ont le même TCR unique. Certains de ces groupes ont été stimulés in vitro par des antigènes spécifiques, tandis que d’autres ont été laissés tels quels, pour servir de comparaisons.

Les deux groupes ont ensuite été séquencés, le TCR non stimulé étant le standard de référence pour identifier les lymphocytes T appartenant au même groupe, stimulés ou non. Cette pratique est appelée phénotypage inverse, car les changements de phénotype sont utilisés pour identifier les effets d’un changement génétique.

Cette méthode a été suivie par les chercheurs pour identifier et étudier les cellules T réactives aux peptides de protéine de pointe SARs-CoV-2. Les cellules provenaient du sang périphérique de patients sévères atteints de COVID-19. Certaines des cellules ont été stimulées par le mélange de peptides, tandis que les cellules présentatrices d’antigène du même patient ont assuré un traitement et une présentation antigéniques appropriés pour l’activation des lymphocytes T.

Le séquençage de l’ARN a montré des schémas transcriptionnels spécifiques dans les populations de cellules T répondant à chacun des antigènes dans le mélange. Ils ont effectué le phénotypage de CD8 et de nombreuses cellules CD4 T helper en même temps, s’assurant ainsi que le test était indépendant de l’haplotype et de l’épitope. Des tests simultanés de nombreux TCR différents ont été effectués pour la réactivité de l’antigène et le profilage fonctionnel.

Ensuite, ils ont exploité la technologie CRISPR / Cas9 pour produire des cellules T exprimant des TCR transgéniques, leur permettant de valider la réactivité antigène-TCR de pointe des TCR à partir de clonotypes spécifiques.

La restimulation peut produire des changements déroutants

Lors de la stimulation, les cellules T CD4 ont été décrites pour montrer une activation précoce et une réponse d’activation tardive, caractérisées respectivement par une réponse IFN et une prolifération des cellules T.

Dans la présente analyse, un seul groupe de cellules CD4 présentant un indice de prolifération élevé a été observé, mais de nombreuses autres cellules ont montré un changement transcriptionnel apparemment non spécifique. Cependant, ces derniers étaient ceux avec un profil d’activation précoce.

Les cellules T CD8 présentent également un profil d’activation précoce et tardive, à savoir une cytotoxicité élevée et des phases de sécrétion de cytokines. Dans cette étude, le premier profil a été observé avec presque toutes les cellules T CD8, mais un seul groupe a montré le deuxième profil. Ce groupe a montré des gènes régulés à la hausse tels que le TNF et l’IFNy. Ils ont observé que toutes les cellules T réactives, que ce soit CD4 ou CD8, convergeaient vers ce cluster.

En réponse à la stimulation, par conséquent, certains marqueurs d’activation sont augmentés, comme prévu, et d’autres montrent des variations plus complexes dans l’expression des marqueurs en dehors des phénotypes supposés stables. Les cellules T CD4 restimulées ont exprimé des cytokines effectrices comme le TNF et l’IFNy, ainsi que le marqueur CD137.

Ils ont également exprimé des molécules co-inhibitrices telles que PD1 et LAG3, qui ont été décrites précédemment comme étant caractéristiques de l’épuisement des cellules T dans les maladies graves. Au lieu de cela, l’étude actuelle indique qu’il s’agit de marqueurs de l’activation des lymphocytes T.

De nombreux marqueurs induits montrent des changements de transcription différentiels dans tous les domaines, au sein des clonotypes, et également entre les clonotypes stimulés vs non stimulés et réactifs vs non réactifs dans l’ensemble.

Cela confirme l’influence de la restimulation in vitro sur les phénotypes des lymphocytes T.

Quelles sont les implications?

L’importance de cette étude réside d’abord dans sa démonstration des changements systématiques de phénotype à la suite de la stimulation antigénique, en comparant le profil transcriptionnel dans les clonotypes antigéniques et antigéniques non réactifs, à la fois avant et après stimulation. Les chercheurs ont pu définir les phénotypes in vivo non perturbés des cellules T activées par les antigènes du SRAS-CoV-2.

Troisièmement, ils ont comparé les lymphocytes T de patients atteints de COVID-19, provenant de diverses sources dans les voies respiratoires, de patients présentant différentes sévérités de la maladie et à différents moments, avec ceux prélevés sur des témoins sains. Ils ont constaté que les cellules T respiratoires des patients atteints de COVID-19 étaient les plus similaires, dans leur schéma transcriptionnel, aux cellules T du sang périphérique après avoir été exposées aux antigènes du SRAS-CoV-2 in vitro. Cela indique qu’ils disent «un phénotype« chaud »entraîné par une activation aiguë au site de l’infection.»

D’un autre côté, le phénotype transcriptionnel des cellules T respiratoires de patients sévères COVID-19 séronégatifs au virus correspondait à ceux des cellules T réactives aux antigènes non perturbées du sang périphérique, indiquant leur phénotype «froid».

Nous présentons les changements transcriptionnels de la maladie aiguë à la résolution après la clairance du virus dans les cellules T CD4 et CD8 réactives à l’antigène au cours de COVID-19. »

En utilisant le phénotypage inverse, ils ont pu recréer les clonotypes réactifs aux antigènes comme ils l’auraient été sans restimulation. Cela leur a permis de « étudier les effets phénotypiques systématiques qui sont introduits par la re-stimulation antigénique in vitro, et d’autre part, explorer le phénotype in vivo non perturbé des cellules T réactives aux antigènes. »

Cet outil pourrait aider à comprendre l’immunité adaptative après une infection virale, en aidant à développer de meilleures thérapies et vaccins pour les nouveaux pathogènes émergents, ainsi que le SRAS-CoV-2.

*Avis important

medRxiv publie des rapports scientifiques préliminaires qui ne sont pas examinés par des pairs et, par conséquent, ne doivent pas être considérés comme concluants, orienter la pratique clinique / les comportements liés à la santé, ou traités comme des informations établies.