Une équipe de chercheurs du MIT a développé un test moléculaire pour détecter les niveaux sous-picomolaires du domaine de liaison au récepteur de la protéine de pointe (S-RBD) du SRAS-CoV-2 à l’aide de balises peptidiques validées informatiquement dans une détection en une seule étape grâce à la production de un signal de fluorescence. L’équipe a publié ses conclusions sur la bioRxiv* serveur de préimpression.
Les tests de diagnostic les plus largement utilisés pour le coronavirus 2 du syndrome respiratoire aigu sévère (SRAS-CoV-2), les agents responsables de la maladie à coronavirus 2019 (COVID-19), sont la transcription inverse-amplification en chaîne par polymérase (RT-PCR) basée sur méthodes – avec des limites de détection (LoD) de 102 à 103 copies d’ARN/ml, ce qui représente environ 1 à 10 ARN attomolaire (aM) dans le volume de test.
Cependant, les tests RT-PCR sont laborieux, nécessitant des étapes coûteuses d’isolement, de purification et de traitement des acides nucléiques. Cela augmente à la fois le délai de détection et le coût des tests. Alors que d’autres technologies basées sur CRISPR et l’amplification à médiation par boucle pour les diagnostics existent, des diagnostics rapides au point de service pour détecter le SRAS-CoV-2 peuvent accélérer la lutte pour contrôler les épidémies de l’infection.
Dans une étude récente, des chercheurs du Massachusetts Institute of Technology (MIT) ont conçu des balises moléculaires, en utilisant une conception de protéines d’apprentissage en profondeur, qui s’allument à des concentrations sous-picomolaires très sensibles du SARS-CoV-2 RBD (domaine de liaison au récepteur ). La balise fonctionne comme un interrupteur conformationnel : s’allume en présence du RBD viral en produisant un signal de fluorescence à l’aide d’une paire fluorophore-extincteur.
Les balises forment un hétérodimère contenant deux peptides ensemble, avec un ligand de liaison entre eux pour détecter la présence de S-RBD.
En l’absence de S-RBD (OFF), les balises peptidiques adoptent une conformation fermée qui s’ouvre lorsqu’elles sont liées au S-RBD, et la paire fluorophore-extincteur aux deux extrémités des tiges d’hétérodimères produit un signal de fluorescence (ON).
Les chercheurs ont démontré que deux balises candidates, C17LC21 et C21LC21, peuvent détecter le RBD avec des limites de détection (LoD) dans la gamme sous-picomolaire.
Notre objectif final est d’intégrer ces balises optimisées dans des microscopes miniaturisés à fluorescence à réflexion interne totale (TIRF), qui offrent une sensibilité exquise en excitant les fluorophores présents à proximité du nanomètre de la surface de l’appareil, produisant des rapports signal/arrière-plan élevés et permettant des rapports rapides et ultra- détection sensible du SARS-CoV-2 », ont déclaré les chercheurs.
Ici, les chercheurs ont utilisé le mécanisme de transfert d’énergie par résonance de Forster (FRET), où l’efficacité du transfert d’énergie entre le fluorophore et l’extincteur est proportionnelle à leur distance spatiale. La présence ou l’absence du S-RBD provoque un petit changement dans la distance spatiale entre les deux bras de balise, modifiant considérablement l’efficacité du FRET.
Ainsi, cela affecte le rendement quantique de fluorescence du fluorophore. L’augmentation du signal de fluorescence est proportionnelle à la quantité de S-RBD présente. Les chercheurs ont utilisé le couple fluorophore-extincteur couramment utilisé : l’isothiocyanate de fluorescéine (FITC) et [4-(N,N-dimethylamino)phenylazo] benzoyle (DABCYL), respectivement.
Les chercheurs ont sélectionné par ordinateur les candidats balises peptidiques (C13LC21, C17LC21 et C21L21) qui ont amarré avec succès le S-RBD séparant les deux bras de balise qui abritent le fluorophore et l’extincteur, passant à la conformation ON.
Après cette confirmation, ils ont testé expérimentalement ces trois modèles de balises peptidiques pour la capacité de liaison avec le S-RBD dans les cellules humaines et pour la réponse de détection. in vitro. Ils ont observé que le C17LC21 montrait la sensibilité la plus élevée vis-à-vis du S-RBD avec une LoD de près de 20 fM (Kd = 1,615 × 10−12), suivi de C21LC21 ayant une LoD de 400 fM (Kd = 6,766 × 10−13).
Ils ont conclu que les C17LC21 et C21LC21 pouvaient détecter la présence de S-RBD avec une sensibilité sous-picomolaire et une faible réactivité croisée. motivant ainsi l’application de ces balises moléculaires pour la détection rapide du SARS-CoV-2.
Ce travail « présente un cas d’utilisation des outils actuels d’apprentissage en profondeur pour la prédiction de la structure des protéines dans un pipeline de conception de protéines », ont déclaré les chercheurs. Ils l’ont démontré en utilisant une approche hybride d’outils de modélisation de protéines de pointe pour la conception de balises moléculaires. Suivie d’une validation expérimentale robuste, cette conception de balise moléculaire sert de plate-forme puissante pour lutter contre le COVID-19 et les futures menaces virales émergentes.
Les chercheurs écrivent :
Dans cette étude, en utilisant des outils d’apprentissage en profondeur existants pour la prédiction de la structure des protéines et des suites de modélisation basées sur l’énergie, nous avons conçu et testé un ensemble de balises moléculaires qui peuvent se lier puissamment au S-RBD et libérer un signal de fluorescence via FRET, permettant niveaux de détection.
L’intégration de ces balises peptidiques dans des capteurs optiques, tels que des microscopes TIRF miniatures, peut réduire la LoD à un niveau sous-femtomolaire, produisant ainsi une plate-forme de diagnostic rapide au point de service pour le SRAS-CoV-2, envisagent les chercheurs.
*Avis important
bioRxiv publie des rapports scientifiques préliminaires qui ne sont pas évalués par des pairs et, par conséquent, ne doivent pas être considérés comme concluants, orienter la pratique clinique/le comportement lié à la santé, ou traités comme des informations établies.
