Dans une récente étude publiée sur bioRxiv* serveur de préimpression, les chercheurs ont fabriqué des tissus corticaux cérébraux en trois dimensions (3D) et les ont intégrés fonctionnellement dans une lésion cérébrale chez la souris.
Sommaire
Arrière plan
L’ingénierie tissulaire de tissus humains cellulairement divers avec les fonctions et architectures cellulaires souhaitées est un défi. L’architecture des tissus corticaux cérébraux est constituée de couches de neurones spécifiques disposés en colonnes orientées verticalement qui offrent une cognition élevée via des circuits neuronaux complexes. Les approches impliquant l’implantation d’organoïdes cérébraux et de cellules progénitrices neurales (NP) ont démontré un succès limité dans la restauration complète des tissus crâniens blessés puisque les cellules implantées ne pouvaient pas fournir une anatomie cellulaire ressemblant au cerveau humain.
À propos de l’étude
Dans la présente étude, les chercheurs ont fabriqué des tissus corticaux cérébraux en couches via une impression 3D à base de gouttelettes et à base de piézoélectricité et ont intégré fonctionnellement les tissus dans une lésion cérébrale chez la souris.
Les cellules souches pluripotentes induites par l’homme (hiPSC) ont été différenciées en NP de couche supérieure (UNP) et en NP de couche profonde (DNP), puis imprimées pour former des tissus à deux couches du cortex cérébral à l’aide de la méthode d’impression à base de gouttelettes. La technique a produit des tissus mous sans échafaudage et structurellement définis comprenant des cellules et l’ECM (matrice extracellulaire).
Les cellules imprimées en 3D avaient subi plusieurs processus de maturation, tels que la différenciation terminale, les excroissances de processus et la migration cellulaire. Ils ont ensuite été implantés dans des explants de lésions cérébrales de souris pour surveiller l’intégration des structures cellulaires pendant sept jours. Des cellules neuronales spécifiques à la couche, des UNP marqués à la protéine fluorescente rouge (RFP) et des DNP non marqués ont été imprimés pour former un DRN double couche 16x8x8 (réseau de gouttelettes) d’une largeur et d’une hauteur de 500 μm et 1000 μm, respectivement, ont été imprimés en couche- par couche pour générer des structures cubiques à l’échelle inférieure au millimètre et des structures à l’échelle centimétrique de formes diverses.
Les hiPSC ont été reprogrammés à partir de cellules somatiques pluripotentes d’un individu sain et immunocolorés. Un NIM (milieu d’induction neurale) contenant les inhibiteurs SMAD (suppresseur des mères contre la décapentaplégie) SB431542 et LDN193189 a été utilisé pour l’induction de cellules hiPSC dans des cellules d’ectoderme neurales qui ont ensuite été cultivées dans un NMM (milieu d’entretien neural) pour permettre la génération de NP in vitro.
Les cellules ont mûri en ensemençant des NP et en utilisant un inhibiteur de la γ-sécrétase (DAPT) contenant du NTM (milieu terminal neural). Les NP ont été traités avec un cocktail de facteurs de croissance, tels que l’EGF, le FGF-2 et le BDNF, similaire au protocole de Boissart. En outre, une analyse de l’expression génique par RT-qPCR (réaction en chaîne par polymérase quantitative en temps réel) a été effectuée pour confirmer l’identité des cellules UN et DN.
Deux DRN 8x8x8 (l’un contenant des UNP et l’autre contenant des DNP) ont été imprimés simultanément pour donner un DRN 16x8x8. L’intégration entre l’hôte et l’implant a été évaluée en fonction du degré d’excroissances du processus et de la migration neuronale du site de l’implant vers celui de l’hôte. La fonctionnalité des tissus implantés a été évaluée sur la base de Ca2+ l’analyse d’imagerie à l’aide de Fluo-4 et les signaux d’ions calcium à l’interface implant/explant ont été enregistrés pour évaluer les corrélations d’oscillation du calcium entre l’hôte et l’implant.
Résultats
Des structures corticales à six couches ressemblant à l’architecture du cortex cérébral humain pourraient être produites par impression 3D à base de gouttelettes. Les cellules NP se sont différenciées parmi les tissus imprimés au cours des cultures de tissus post-impression. Fait intéressant, les UNP et les DNP ont continué à mûrir dans l’hôte, bien qu’ils soient présents dans un milieu de croissance commun. La production de tissus comprenant différents types de neurones sans manipulation génétique réduit les problèmes de sécurité et pourrait être appliquée à la construction de tissus cellulairement diversifiés.
Les implants 3D imprimés par gouttelettes pourraient être conçus avec une orientation, une dimension, une structure et une composition similaires à celles des tissus blessés/perdus, avec des gouttelettes de 100 μm de diamètre comprenant des cellules et l’ECM. L’implantation des tissus corticaux cérébraux imprimés et en couches dans des explants de cerveau de souris a montré une intégration structurelle basée sur les excroissances du processus implant-hôte et la migration neuronale et l’intégration fonctionnelle basée sur les oscillations Ca2 + corrélées hôte-implant.
Les NP se différencient principalement en neurones de couche profonde (DN) qui expriment le biomarqueur de couche profonde CTIP2. Les cellules immunocolorées ont montré une expression élevée des marqueurs de pluripotence NANOG, OCT4 (Octamer-binding transcription factor 4) et TRA-1-60 (locus alpha du récepteur des cellules T). Le neurone supérieur (UN) ressemblait morphologiquement aux neurones de la couche profonde (DN); cependant, une expression élevée de marqueurs de couche supérieure tels que BRN2 et homeobox en forme de coupe (CUX) 1, 2 et le marqueur de la couche intermédiaire SATB2 (protéine de liaison à la séquence spéciale riche en AT 2) ont été observés.
Par rapport aux hiPSC, le traitement par cocktail de facteurs de croissance a considérablement amélioré l’expression de CUX1 dans les UNP et les UN de 20 fois et 22 fois, respectivement. L’expression du marqueur de cellules souches neurales de la protéine à boîte appariée (PAX6) était élevée parmi les DNP, ce qui indique le succès de l’induction des neurones corticaux. Expression élevée de NESTIN (protéine de cellule souche neuroépithéliale), TUJ1 (tubuline bêta de classe III) et SOX2 (région déterminante du sexe Y-boîte 2) ont été observées parmi les cellules, indiquant qu’elles étaient neurales. Une expression élevée du marqueur neural HNCAM (molécule d’adhésion des cellules neurales humaines) a été observée dans les cellules de la couche corticale, indiquant des neurones d’origine humaine.
Conclusion
Dans l’ensemble, les résultats de l’étude ont montré que la technique d’impression tridimensionnelle pouvait être utilisée pour produire des tissus avec des colonnes corticales cérébrales à double couche simplifiées. La structure et l’identité des couches supérieures et profondes ont été préservées in vitro post-impression, et des excroissances de processus et la migration neuronale des cellules matures de l’implant à l’hôte ont été observées. L’implantation de tissu cortical imprimé en 3D dans des explants de tissu cérébral de souris a montré une intégration fonctionnelle et structurelle de l’implant dans l’hôte.
*Avis important
bioRxiv publie des rapports scientifiques préliminaires qui ne sont pas évalués par des pairs et, par conséquent, ne doivent pas être considérés comme concluants, guider la pratique clinique/les comportements liés à la santé, ou traités comme des informations établies.
