Dans une étude récente publiée dans la revue Communications naturelles, les chercheurs ont développé des poulets résistants à la grippe aviaire grâce à l’édition de répétitions palindromiques courtes régulièrement espacées (CRISPR/Cas9) multi-gènes, ciblant la phosphoprotéine nucléaire acide 32 (ANP32)A, ANP32B et ANP32E pour inhiber la réplication virale et empêcher les mécanismes d’évasion virale.
Étude : Création d’une résistance à l’infection par la grippe aviaire grâce à l’édition génomique de la famille de gènes ANP32. Crédit d’image : Sonsedska Yuliia/Shutterstock
Arrière-plan
Les virus de la grippe A (IAV) présentent d’importants risques économiques, sanitaires et pandémiques à l’échelle mondiale en raison de leur impact sur la volaille et de leur potentiel d’infection humaine. Les stratégies de contrôle actuelles, comme la vaccination, sont peu fiables et controversées, ce qui souligne la nécessité de solutions innovantes. L’interaction entre l’acide ribonucléique (ARN) polymérase de l’IAV et les protéines ANP32 spécifiques de l’hôte est la clé de la capacité du virus à infecter différentes espèces. Cependant, des solutions globales nécessitent des recherches plus approfondies sur l’adaptation virale, l’efficacité de l’édition multigénique et les conséquences plus larges de ces changements génétiques.
À propos de l’étude
Les œufs fertiles provenant de troupeaux de pondeuses Hy-line du National Avian Research Facility au Royaume-Uni (Royaume-Uni) ont été utilisés dans des expériences conformes à la réglementation britannique, examinés par des comités d’éthique et menés par du personnel agréé. Les cellules germinales primordiales (PGC) ont été extraites des œufs, cultivées et développées avant l’édition génétique. Divers vecteurs CRISPR/Cas9 ont été utilisés pour l’édition, avec des séquences sélectionnées à l’aide d’un outil de conception et synthétisées par des sociétés comme Invitrogen et Integrated désoxyribonucléic acid (DNA) Technologies. Plusieurs stratégies ont été utilisées pour modifier les gènes ANP32A, ANP32B et ANP32E. Les cellules modifiées ont été criblées par réaction en chaîne par polymérase (PCR) et séquençage de Sanger, avec des amorces spécifiques pour chaque altération génique.
Pour l’analyse du transcriptome, les PGC ont été développées, l’ARN a ensuite été extrait et soumis à des contrôles de qualité, puis utilisé pour la construction d’une bibliothèque d’ADN complémentaire (ADNc), suivie par des performances de séquençage d’ARN, les lectures résultantes étant soumises à une filtration et à une analyse de qualité. Les données ont été cartographiées sur l’assemblage du génome du poulet et une analyse de l’expression différentielle a été réalisée. Ce processus approfondi a assuré une étude et une modification minutieuses et réglementées des gènes au sein des PGC à des fins de recherche.
Dans l’étude, l’expression de l’ANP32A a été analysée à la fois dans des cellules génétiquement modifiées et dans des embryons ANP32A-knockout (AKO), en utilisant le tampon de lyse Radioimmunoprecipitation Assay Buffer (RIPA) et une série de protocoles de lyse et de Western blot ultérieur. Des anticorps spécifiques ont été utilisés dans la phase d’immunotransfert, suivie d’un processus de visualisation impliquant le système d’imagerie Odyssey. Dans une autre expérience, 150 000 PGC ont subi une différenciation en cellules de type fibroblaste grâce à une série d’incubations et de changements de milieu, avec des conditions et des ingrédients spécifiques pour le milieu de culture. Les cellules du rein canin Madin-Darby (MDCK) ont été maintenues dans des conditions spécifiques et un ensemble spécial de cellules eHAP1 humaines à triple knock-out a été utilisé.
L’activité polymérase de la grippe a été évaluée à l’aide d’un système de minigénome de poulet polI et de divers plasmides. Différentes procédures et ingrédients ont été suivis pour la transfection, l’incubation et la lyse avant d’évaluer la bioluminescence. Les expériences in vivo ont impliqué des poulets pondeurs Hy-line avec des procédures spécifiques de logement, d’inoculation et de surveillance pour étudier la transmission du virus de la grippe. Divers tests ont été utilisés pour le titrage du virus, notamment le test des plages sur les cellules MDCK et les tests d’inhibition de l’hémagglutination.
En outre, les virus isolés à partir d’écouvillons de poulet ont été séquencés après inoculation dans des œufs de poulet et récolte de fluides, avec des protocoles détaillés d’extraction d’ARN, d’amplification PCR et de séquençage. Les études d’infection sur les cellules épithéliales des voies respiratoires humaines impliquaient des protocoles spécifiques de lavage, d’infection et de récolte. Un test de compétition a été réalisé entre différentes souches de virus dans des œufs de poule ou des cellules humaines, avec une procédure méticuleuse d’extraction d’ARN, de génération d’ADNc et d’amplification PCR.
L’analyse statistique a été réalisée à l’aide de diverses méthodes en fonction de l’expérience, notamment des tests T et des analyses de variance (ANOVA), avec des illustrations représentées graphiquement pour plus de clarté et une interprétation complète.
Résultats de l’étude
Les chercheurs ont utilisé CRISPR/Cas9 et un modèle court d’oligonucléotide simple brin (ssODN) pour concevoir une altération infime mais significative du gène ANP32A du poulet, dans le but de contrecarrer la réplication de l’IAV. Cette altération, exécutée dans les PGC, a été méticuleusement analysée, ne révélant aucune mutation hors cible ni changement significatif de l’expression génique. Notamment, l’activité de l’IAV polymérase a été entravée dans les cellules éditées, soulignant le rôle de l’ANP32A dans la réplication virale.
un Schéma d’une provocation in vivo à faible dose de poulets âgés de 2 semaines avec le virus de la grippe A H9N2-UDL (A/chicken/Pakistan/UDL01/08). Les poulets ont été hébergés dans des isolateurs à pression négative. Avant l’épreuve, tous les oiseaux ont été saignés de la veine de l’aile pour obtenir des sérums de pré-infection. Groupes de dix poulets WT (noirs) ou dix ANP32AN129I-D130N (blancs) ont été inoculés par voie intranasale avec 1 × 103 PFU du virus H9N2-UDL par oiseau. Des poulets sentinelles non inoculés ont été introduits dans les isolateurs 24 heures après l’infection afin d’évaluer la transmission à partir des oiseaux directement inoculés. Les cavités oropharyngées de chaque oiseau ont été frottées quotidiennement à partir du jour de l’inoculation (J0) jusqu’au jour 7 (J7) après l’inoculation. Le titre en virus infectieux dans les écouvillons a été mesuré par test sur plaque sur cellules MDCK (b, c). c Numéro d’identification de l’oiseau pour l’ANP32A directement inoculéN129I-D130N les oiseaux au-dessus de la limite de détection sont indiqués. Limite de détection DL de 10 PFU/ml pour le test de plaque.
L’intervention génétique a été exécutée en transférant des PGC modifiés dans des embryons hôtes, conduisant à la naissance de poulets vivants générant uniquement des gamètes modifiés. Ces oiseaux ont ensuite été accouplés, avec une progéniture portant la modification génétique souhaitée. Les observations ont indiqué un développement, un comportement et une croissance normaux chez les poulets édités, similaires à ceux de leurs homologues sauvages.
L’efficacité de cette modification génétique a été testée en exposant les poulets à l’IAV. Remarquablement, alors que le virus prospérait chez les oiseaux de type sauvage, il était pratiquement inactif au sein de la population éditée par ANP32A, à l’exception d’un cas d’activité virale réduite. Des tests sérologiques ultérieurs ont largement corroboré l’absence d’infections actives au sein du groupe édité, faisant allusion au potentiel de cette approche génétique pour rendre les poulets résistants à l’IAV, une avancée ayant des implications substantielles pour la santé aviaire et les industries associées.
La résilience des poulets édités a ensuite été évaluée par rapport à une exposition accrue à l’IAV. Même soumis à une dose de virus mille fois plus élevée, les poulets modifiés n’ont présenté aucun signe d’infection, contrairement au groupe de type sauvage qui présentait une activité et une transmission virales prononcées. Une excrétion virale minimale et sporadique a été notée parmi les poulets édités, indiquant un ralentissement significatif de l’activité virale et de sa propagation en raison de la modification génétique.
Une analyse approfondie des virus provenant des poulets édités a révélé des mutations spécifiques, notamment au sein de l’AP. à savoir gène de la protéine acide polymérase et PB2 à savoir gènes de la protéine basique polymérase 2. Ces mutations ont amélioré l’interaction entre la polymérase virale et la protéine ANP32A modifiée, une découverte ayant des implications potentielles pour la santé humaine, car les mêmes mutations ont également amélioré l’efficacité du virus avec les protéines ANP32 humaines. Cependant, ces mutations n’offraient pas d’avantage distinct dans les cellules ou les œufs de poulet, ce qui suggère une plus grande complexité dans l’adaptation humaine potentielle du virus, nécessitant éventuellement des altérations supplémentaires dans la protéine virale hémagglutinine (HA).
Des examens structurels plus approfondis suggèrent que les effets de ces mutations pourraient être médiés par des changements structurels indirects plutôt que par des interactions directes avec la protéine ANP32A, soulignant la dynamique complexe hôte-virus dans la barrière des espèces de la grippe et les risques d’adaptation.
De plus, face à l’absence d’ANP32A, le virus d’échappement double mutant H9N2-UDL PA-349K PB2-M631L s’est répliqué dans des embryons de poulet, ce qui témoigne de son adaptabilité. Les expériences ont en outre révélé que la suppression complète de l’ANP32A n’a pas entièrement dissuadé certaines souches mutantes de la grippe, ce qui suggère la nécessité de modifications plus larges dans toutes les variantes de l’ANP32 pour obtenir une résistance complète à la grippe chez les poulets.
