Une équipe de scientifiques basés aux États-Unis a mis au point une méthode de séquençage basée sur des amplicons pour le virus du monkeypox humain. La méthode a une couverture du génome viral plus élevée et peut même analyser des échantillons avec une faible concentration d’ADN viral. L’étude est actuellement disponible sur le medRxiv* serveur de préimpression.
Sommaire
Arrière plan
Le séquençage du génome entier des agents pathogènes joue un rôle vital important dans l’identification de nouvelles variantes et la surveillance de leur propagation lors de toute épidémie/épidémie. Au cours de la pandémie de maladie à coronavirus 2019 (COVID-19), plus de 13 millions de génomes viraux isolés dans 103 pays ont été séquencés et rendus publics. Cela a considérablement contribué à accélérer la recherche fondamentale et clinique axée sur la pathogenèse, le diagnostic, la prophylaxie et la thérapeutique des maladies.
Monkeypox est un virus à ADN zoonotique initialement endémique d’Afrique centrale et occidentale. En 2022, plusieurs épidémies d’infections à monkeypox ont été observées dans des pays non endémiques, notamment au Royaume-Uni et aux États-Unis. Initialement, l’approche métagénomique a été employée pour séquencer le génome du monkeypox. Cependant, cette méthode est coûteuse et nécessite des échantillons avec des concentrations élevées d’acide nucléique viral.
Dans l’étude actuelle, les scientifiques ont développé et validé un schéma d’amorce pour le virus de la variole du singe humain qui peut être utilisé avec des flux de travail de séquençage basés sur des amplicons.
Développement et validation du schéma d’amorçage
Les scientifiques ont conçu le schéma d’amorce du monkeypox humain avec PrimalScheme en utilisant un génome viral pré-épidémie appartenant à la lignée A.1. Le schéma d’amorce comprenait 163 paires d’amorces avec une longueur moyenne d’amplicon de 1977 pb.
Le schéma d’amorce a été initialement utilisé pour séquencer dix échantillons cliniques avec des gammes variées de concentrations d’ADN viral avec un séquençage à base d’amplicon et comparé au séquençage métagénomique.
Les résultats ont révélé que les deux approches de séquençage fournissent une couverture génomique comparable pour les échantillons à fortes concentrations d’ADN viral. Cependant, pour les échantillons à faibles concentrations d’ADN, le séquençage basé sur les amplicons a entraîné une couverture génomique considérablement accrue.
Dans l’ensemble, ces observations indiquent que le séquençage basé sur les amplicons à l’aide d’un schéma d’amorce peut améliorer la couverture du génome du monkeypox dans les échantillons cliniques à faible teneur en ADN viral.
Une validation supplémentaire du schéma d’amorce a été effectuée en collaborant avec 12 laboratoires de santé publique aux États-Unis et dans d’autres pays. Ces laboratoires ont utilisé des approches de séquençage Illumina ou Oxford Nanopore Technology pour analyser des échantillons cliniques avec diverses concentrations d’ADN viral.
Les résultats ont révélé que le schéma d’amorce monkeypox pouvait être utilisé avec divers flux de travail et plates-formes de séquençage pour obtenir une couverture génomique élevée pour les échantillons à forte ou faible teneur en ADN.
Bien que la plupart de ces échantillons soient des écouvillons de lésions, quelques écouvillons oropharyngés prélevés dans la gorge avec ou sans lésions ont été séquencés à l’aide d’un schéma d’amorce. Les résultats ont révélé que les échantillons oropharyngés pourraient être utilisés comme type d’échantillon alternatif pour obtenir un séquençage quasi-complet du génome viral.
Une validation plus poussée du protocole a révélé que les échantillons cliniques avec une valeur Ct inférieure à 29 doivent être utilisés pour le séquençage. Au moins un million de lectures par échantillon doivent être générées pour maximiser la couverture du génome. L’augmentation des valeurs Ct et la réduction des lectures de séquençage par échantillon pourraient entraîner une faible couverture du génome, comme l’ont mentionné les scientifiques.
La valeur Ct obtenue à partir de la réaction en chaîne par polymérase (PCR) est une mesure de substitution de la quantité d’acide nucléique dans les échantillons. Plus la valeur Ct est élevée ; plus la teneur en acides nucléiques est faible.
Importance de l’étude
L’étude décrit le développement et la validation d’une approche de séquençage basée sur les amplicons pour le virus de la variole du singe humain qui peut être utilisée comme alternative à faible coût et à haut débit au séquençage métagénomique.
Comme mentionné par les scientifiques, ce schéma d’amorce peut être utilisé avec les flux de travail de séquençage SARS-CoV-2 actuels et les plates-formes de séquençage Illumina ou Oxford Nanopore Technology.
De manière significative, cette approche de séquençage basée sur les amplicons peut augmenter la sensibilité, l’étendue et la profondeur de la couverture du génome du monkeypox dans les échantillons cliniques avec de faibles concentrations d’ADN viral. Cela facilitera la surveillance génomique des épidémies de monkeypox dans le monde.
*Avis important
medRxiv publie des rapports scientifiques préliminaires qui ne sont pas évalués par des pairs et, par conséquent, ne doivent pas être considérés comme concluants, guider la pratique clinique/les comportements liés à la santé, ou traités comme des informations établies.
