Dans une récente étude publiée sur Journal de toxicologie biochimique et moléculaireles chercheurs ont examiné des diagnostics basés sur des répétitions palindromiques courtes régulièrement espacées (CRISPR) pour détecter le coronavirus 2 du syndrome respiratoire aigu sévère (SARS-CoV-2).
Étude : Diagnostics au point de service basés sur CRISPR incorporant les enzymes Cas9, Cas12 et Cas13 avancées pour la détection du SRAS-CoV-2. Crédit d’image : Meletios Verras/Shutterstock
La pandémie de maladie à coronavirus 2019 (COVID-19) causée par le SRAS-CoV-2 a eu des effets néfastes sur la vie humaine, la santé publique et l’économie. Le diagnostic de l’infection par le SRAS-CoV-2 repose sur la détection des acides nucléiques viraux (acide ribonucléique [RNA]) ou des antigènes. Bien que les tests de transcription inverse-amplification en chaîne par polymérase (RT-PCR) soient largement utilisés pour la détection du SRAS-CoV-2, ils sont coûteux, laborieux et nécessitent un personnel qualifié. Ces limites imposent essentiellement la nécessité de tests rapides et précis au point de service (POC).
Dans la présente revue, les chercheurs ont discuté des technologies basées sur CRISPR, en mettant l’accent sur trois protéines associées à CRISPR (Cas), à savoir Cas9, Cas12 et Cas13, pour le diagnostic de COVID-19.
Sommaire
Tests de diagnostic intégrant le système CRISPR-Cas9
L’un des plus grands orthologues Cas9 provient de Francisella novice (Fn), et les interactions de FnCas9 avec l’ARN désoxy (ADN) impliquent principalement le motif adjacent au protospacer 5′-NGG-3′ (PAM). L’interrogation de l’ADN par CRSPR-FnCas9 et le clivage ultérieur du duplex d’ADN constituent une méthode précise et rapide pour détecter les variants mononucléotidiques (SNV), à condition que la discrimination de l’ADN soit constante tout au long de la séquence génomique.
Cette approche a été appelée test de détection uniforme lié à l’éditeur FnCas9 (FELUDA), développé par l’Institut de génomique et de biologie intégrative (IGIB) et le groupe Tata. FELUDA, un test de bandelette sur papier pour le SRAS-CoV-2 approuvé en Inde, nécessite la même méthode d’échantillonnage que la PCR quantitative (qPCR), dans laquelle des écouvillons naso- et oropharyngés et des échantillons de salive sont prélevés pour l’isolement de l’ARN.
L’ARN extrait est soumis à une RT-PCR optimisée en une seule étape sur un instrument de PCR standard plutôt qu’à la qPCR à prix élevé, et les amplicons résultants sont biotinylés. Ensuite, les acides nucléiques amplifiés sont mélangés et incubés avec un mélange FELUDA comprenant de l’ARN guide (ARNg) marqué avec de l’amidite fluorescent (FAM) et du FnCas9 désactivé (dFnCas9).
Le complexe de la ribonucléoprotéine Cas9 (RNP) se lie à la cible de 20 nucléotides spécifiquement s’il héberge la séquence signature du SARS-CoV-2. Une fois que la séquence cible est localisée par le complexe RNP, elle se déplace avec les nanoparticules d’or. Les nanoparticules capturent les complexes RNP en adhérant au FAM à l’extrémité 3′ de l’ARNg. Ces nanoparticules sont mélangées à de la streptavidine. Le complexe FELUDA lié aux nanoparticules est capturé par la liaison streptavidine-biotine.
La bande de test (sur la bande) serait colorée lorsque la séquence virale cible est présente, tandis que les nanoparticules non liées sont capturées sur la bande de contrôle. Ainsi, les échantillons positifs donnent deux bandes et les échantillons négatifs une seule bande. Les preuves suggèrent que le test est sensible à 97 % et spécifique à 100 % avec une limite de détection de 10 copies d’ARN viral/μl. La méthode FELUDA nécessite une expertise technique minimale sans instruments coûteux mais est limitée par l’exigence d’un thermocycleur.
Utilisation du système CRISPR-Cas12
Cas12 représente une alternative à Cas9 compte tenu de ses caractéristiques uniques, comme l’absence de trrépond-unactiver RCARN ISPR (tracrARN) et capacité à cibler des motifs enrichis en thymidine. Les techniques basées sur CRISPR pour la détection du SRAS-CoV-2 utilisent souvent Cas12 pour identifier les séquences virales et s’appuient sur des méthodes d’amplification isotherme comme l’amplification par recombinase polymérase (RPA) et l’amplification isotherme médiée par boucle (LAMP). De plus, ces méthodes sont idéalement moins coûteuses compte tenu de l’absence de thermocycleur.
L’essai basé sur CRISPR appelé « rapporteur trans CRISPR ciblé par endonucléase d’ADN (DETECTR) » effectue une transcription inverse et une LAMP (RT-LAMP) simultanées suivies de la détection des séquences du SARS-CoV-2 de manière précise, rapide et sensible.
Détection du SRAS-CoV-2 basée sur CRISPR-Cas13
Sspécifique hhaute sensibilité enzymatique reporter unbloquering (SHERLOCK) est un test de diagnostic basé sur CRISPR-Cas13 qui comprend un mélange de détection composé de Cas13a, d’ARNc personnalisé et d’un ARN rapporteur (capteur d’ARN) avec un extincteur et un fluorophore. L’échantillon contenant la séquence d’ARN cible conduira au clivage de l’ARN rapporteur entraînant la libération de fluorophore collatéralement. Par conséquent, la fluorescence est un indicateur d’un résultat de test positif.
De plus, des cibles uniques pourraient être détectées à l’aide de dispositifs/bandes/dosages à flux latéral commerciaux. La méthode de détection pour ces essais à flux latéral utilise un capteur d’ARN de quelques nucléotides au centre et est marqué avec de la biotine et du FAM aux extrémités. La streptavidine se lie à la biotine et un anticorps marqué avec des nanoparticules d’or spécifiques au FAM se fixe au capteur d’ARN près du fluorophore, ce qui donne une couleur violet foncé au niveau de la bande de test. Deux bandes, contrôle et test, indiquent un résultat de test positif, et un résultat négatif est indiqué par la présence de la seule bande de contrôle.
Il a été rapporté que le test SHERLOCK pour la détection du SRAS-CoV-2 est spécifique à 96 % et efficace à 100 % pour identifier les séquences virales. De plus, un test SHERLOCK modifié qui permet une amplification sans PCR est 100 % sensible et spécifique.
Une étude a démontré une méthode contournant l’extraction d’acides nucléiques à partir d’échantillons. Cela a été rapporté comme hen mangeant tusuivant rédiagnostic samples à oblittéraire nucleases (HUDSON). En intégrant HUDSON et SHERLOCK, les chercheurs ont conçu un outil de diagnostic appelé srationalisé hmise en lumière de jeinfections à nnaviguer eépidémies (SHINE). SHINE est avantageux sur SHERLOCK; en ce qu’il s’agit d’une procédure en une seule étape, et la fluorescence est détectée par un smartphone, ce qui en fait un outil évolutif et à haut débit permettant une analyse automatisée des données.
conclusion
Alors que la RT-PCR reste la référence pour détecter le SRAS-CoV-2, il est nécessaire de développer des tests de diagnostic rapides, fiables, précis et abordables. Les diagnostics basés sur CRISPR pourraient potentiellement servir d’alternatives viables aux tests PCR conventionnels, et en outre, ces tests pourraient également être repensés pour détecter d’autres agents pathogènes.
