Dans une récente étude publiée sur bioRxiv* serveur de préimpression, les chercheurs ont étudié l’activité de la protéine d’enveloppe (E) du coronavirus 2 du syndrome respiratoire aigu sévère (SRAS-CoV-2) en termes de cations de calcium (Ca2+) cations.
Les canaux ioniques fonctionnels sont essentiels dans les cycles infectieux de plusieurs virus car les virus modifient l’équilibre ionique de l’hôte (en particulier Ca2+) pour faciliter leur assimilation, leur maturation et leur exportation. Les viroporines codées dans les génomes viraux sont essentielles pour modifier l’homéostasie ionique et cellulaire. Le SRAS-CoV-2 E forme des canaux ioniques dans les membranes du réticulum endoplasmique (RE)-compartiment intermédiaire de Golgi (ERGIC) en association avec la virulence du SRAS-CoV-2 et la progression de l’infection.
Des études ont rapporté que des mutations de blocage, de délétion ou de perte de fonction dans les protéines CoV E peuvent générer des variants viraux atténués ou dépourvus de propagation ; cependant, les fonctions physiologiques précises du SRAS-CoV-2 E ne sont pas bien caractérisées et nécessitent des investigations supplémentaires.
À propos de l’étude
Dans la présente étude, les chercheurs ont exploré la fonction physiologique principale du SRAS-CoV-2 E lors d’une infection virale.
Une construction de protéine E comprenant la séquence E pleine longueur ou les résidus 1 à 75 (EFL) a été produite, purifiée à partir de E. coli corps d’inclusion, et reconstitués dans des membranes de phosphatidyléthanolamine (PE) dans des conditions de voltage imposé. Des oligomères EFL ont été formés et confirmés par analyse Western blot et photométrie de masse (MP).
Des simulations de dynamique moléculaire (MD) ont été réalisées et des mesures électrophysiologiques de voltage-clamp ont été enregistrées pour quantifier le Ca2+ activité du canal. La structure liée à la membrane et les activités fonctionnelles des canaux ioniques du SRAS-CoV-2 E ont été étudiées. La pentamérisation EFL a été réalisée et confirmée par chromatographie d’exclusion stérique couplée à une analyse par diffusion de lumière multi-angle (SEC-MALS).
De plus, les effets des modifications post-traductionnelles (PTM) sur la fonction de la protéine E ont été explorés en palmitoylant tous les résidus de cystéine (Cys40, Cys43, Cys44) dans chaque sous-unité des pentamères EFL des canaux protéiques SARS-CoV-2 E. De plus, les effets des concentrations luminales de Ca2+ sur les propriétés de déclenchement EFL ont été évalués.
L’équipe a étudié si le site transmembranaire (TM) formait des sous-structures fonctionnelles EFL, pour lesquelles ETM a été produit comprenant les résidus 8 à 38 de la protéine E virale, par synthèse de peptides en phase solide et a évalué la fonctionnalité ETM in-vitro. L’équipe a cherché à savoir si l’ETM était inséré dans des bicouches lipidiques planes PE dans des conditions de tension imposée et a effectué des simulations MD sur les domaines ETM dans les pentamères assemblés.
Résultats
SARS-CoV-2 E formé Ca2+-canaux ioniques perméables dans les bicouches lipidiques planes, qui dépendaient du déclenchement hydrophobe et des lipides. La protéine virale E présentait un anneau de liaison pour Ca2+ ions à l’entrée des pores luminaux qui ont stabilisé les pores à l’état ouvert. En conséquence, les cations calcium ont augmenté les durées d’ouverture des pores et des courants ioniques traversant les canaux ioniques de la protéine E.
L’activité du canal ionique à porte hydrophobe de la protéine virale E et des viroporines était régulée par une élévation du Ca2 luminal+ concentrations (0,1 mM à 1,0 mM), gradients électrochimiques, pH, PTM, phospholipides ERGIC avec charges négatives et tension appliquée aux membranes. La palmitoylation de ≥ 1 résidu de cystéine a favorisé la formation de pores de protéine E ouverts et stables. Ca2+ les ions ont activé les canaux ER-luminaux et maintenu les pores à l’état ouvert.
Ca2+-Les interactions des résidus glutamiques ont modifié la conformation de la protéine E et favorisé l’ouverture des canaux ioniques et le flux d’ions dans et à travers les canaux. Le site distinctif de liaison au calcium dans les canaux E a servi de région de recrutement pour les ions et de site d’activation dans les pores. Les résultats des analyses SEC-MALS et MP ont montré que les pentamères EFL étaient les états dominants de la construction de la protéine E. La protéine E a montré une sélectivité cationique par rapport aux anions, avec Cl– perméabilité au tiers de Na+ perméabilité.
En utilisant Ca2+ en tant que cation perméant, l’équipe a observé l’incorporation de plusieurs canaux et des événements ouverts fréquents mais brefs à plusieurs états ouverts et une perméabilité plus élevée de la viroporine à Na+ que Ca2+ ions. Les expériences de tension ont montré que la protéine E était très probablement un pore voltage-dépendant régulé par électromouillage et un motif de déclenchement hydrophobe (comprenant Phe20, 23 et 26 résidus) situé au centre du pore.
Le domaine TM, individuellement, n’a pas formé de sous-structures physiologiquement fonctionnelles de la protéine E virale. Par conséquent, les constructions de domaine peuvent ne pas être des modèles appropriés pour mieux comprendre la fonction et la structure de la protéine E virale pour le développement de médicaments anti-SARS-CoV-2. Ca2+ la libération via le pore de la protéine virale E dépendait fortement de Ca2+ charges et Ca2+ l’épuisement des stocks en dessous du seuil ou la modulation de la région de liaison des ions positifs pourrait abolir le Ca2 médié par le SARS-CoV-2 E+ flux. La découverte est essentielle, compte tenu des preuves de dérégulation des ions calcium dans les cellules de la maladie à coronavirus 2019 (COVID-19).
Dans l’ensemble, les résultats de l’étude ont mis en évidence le rôle physiologique du SARS-CoV-2 E impliquant Ca2+ sortie de l’ER et que le Ca2 distinctif+ La région d’activation pourrait être potentiellement ciblée pour le développement d’agents anti-CoV basés sur des mécanismes de blocage des canaux ioniques. Les résultats ont mis en évidence de nouveaux sites d’interaction ionique et lipidique sur le SRAS-CoV-2 E qui pourraient être ciblés pour développer des médicaments anti-SRAS-CoV-2, empêchant potentiellement une stimulation excessive fatale des réponses immunitaires de l’hôte et traitant la partie la moins sujette à la substitution d’acides aminés du protéome du SRAS-CoV-2.
*Avis important
bioRxiv publie des rapports scientifiques préliminaires qui ne sont pas évalués par des pairs et, par conséquent, ne doivent pas être considérés comme concluants, guider la pratique clinique/les comportements liés à la santé, ou traités comme des informations établies.
