La recherche révèle que la dynamique d’assemblage des condensats de protéines de nucléocapside peut être régulée par de petites molécules au potentiel thérapeutique

Dans une récente étude publiée sur bioRxiv*, les chercheurs ont développé une plateforme de criblage et identifié des molécules à activité anti-coronavirus (anti-CoV).

Arrière plan

Les condensats biomoléculaires sont des organites sans membrane formés par séparation de phases liquide-liquide de protéines ou d’acides ribonucléiques (ARN). La formation de condensats liquides appelés viroplasmes a été notée pour les virus de la famille des Reoviridae et de l’ordre des Mononegavirales et est déclenchée par les ARN viraux et les protéines lors de l’infection.

Les viroplasmes servent de plaques tournantes pour la concentration de facteurs hôtes/viraux impliqués dans l’entrée cellulaire, la réplication et l’assemblage et l’emballage du virion. Pour le syndrome respiratoire aigu sévère (SRAS)-CoV-2, sa nucléocapside entraîne l’emballage des virions. Des études récentes rapportent sa capacité à former des condensats liquides, soulevant des spéculations selon lesquelles les condensats de nucléocapside pourraient se comporter comme des viroplasmes dynamiques.

Dernièrement, des études ont identifié de petites molécules modulant la transition de phase des protéines impliquées dans l’infection par le virus respiratoire syncytial (VRS) et la sclérose latérale amyotrophique (SLA). Cela a accru l’intérêt pour le ciblage des condensats pour la découverte de médicaments ; cependant, seules quelques molécules ont été identifiées.

À propos de l’étude et des résultats

Dans la présente étude, les chercheurs ont développé une plateforme de criblage cellulaire pour explorer de petites molécules modulant la condensation de la nucléocapside. Premièrement, les chercheurs ont exprimé sept protéines de nucléocapside du CoV humain (HCoV) dans des cellules A549. Ils ont observé une localisation cytoplasmique diffuse des nucléocapsides du SRAS-CoV-1, du HCoV-OC43, du syndrome respiratoire du Moyen-Orient (MERS)-CoV et du SRAS-CoV-2.

En revanche, les protéines de nucléocapside des HCoV -229E, NL63 et HKU1 ont formé des condensats sphériques (constitutifs). Par conséquent, la tendance à la séparation des phases et à la condensation différait entre les espèces de nucléocapsides. Des condensats de nucléocapside ont été générés pour les sept espèces lors de la transfection d’acide polyinosinique-polycytidylique (polyIC), qui imite les intermédiaires de réplication virale et provoque des réponses immunitaires innées.

Les condensats de nucléocapside induits par PolyIC de SARS-CoV-2, SARS-CoV-2, MERS-CoV et HCoV-HKU1 étaient beaucoup plus dynamiques que les condensats constitutifs. Ensuite, l’équipe a émis l’hypothèse que de petites molécules capables de moduler le comportement de phase des condensats de nucléocapside exerceraient des fonctions antivirales.

Ainsi, deux cribles parallèles ont été développés pour identifier les molécules qui inhibent ou favorisent la condensation. Des cellules A549 exprimant la nucléocapside du SARS-CoV-2 ont été incubées avec 10 μM de composés de la bibliothèque Selleck. De plus, les cellules ont été incubées séparément avec du polyIC 17 heures après l’ajout du composé (pour identifier les inhibiteurs).

Six composés qui augmentaient le nombre de points lacrymaux de la nucléocapside par cellule ont été identifiés. Il s’agissait d’inhibiteurs de la glycogène-synthase kinase 3 (GSK3) et des protéasomes. Le CP21R7 et l’autophinib (inhibiteurs de GSK3) étaient des procondensateurs. Le composé LY2090314 était le plus puissant pour induire la condensation. La phosphorylation de la nucléocapside a été puissamment inhibée par le traitement de 1 μM de LY2090314, tandis que 1 μM de CP21R7 a inhibé la phosphorylation à un degré moindre.

Des expériences de perte et de gain de fonction ont été réalisées pour tester si GSK3 était effectivement la cible des pro-condensateurs. Une condensation robuste de la nucléocapside du SRAS-CoV-2 était évidente lors de la stimulation des cellules avec un ligand qui active la signalisation Wnt, conduisant à l’inhibition de GSK3. De même, l’effet des inhibiteurs de (GSK3) a été récapitulé après l’inactivation de GSK3α ou GSK3β. Le double knock-out a eu un effet plus puissant que les simples knock-out de l’une ou l’autre des GS kinases.

La condensation des nucléocapsides de sept HCoV (dans les cellules A549) était reproductible avec les inhibiteurs de GSK3 de manière dose-dépendante. De plus, LY2090314 a induit une séparation de phase des nucléocapsides de plusieurs CoV de chauve-souris (WIV1, HKU4, HKU8, HKU10 et RaTG13). Ces données ont indiqué que GSK3 module négativement la condensation de la nucléocapside des HCoV et des chauves-souris CoV.

En outre, les auteurs ont noté que les inhibiteurs de GSK3 pourraient également induire le durcissement des condensats de nucléocapside avec une dynamique beaucoup plus lente que les condensats induits par polyIC. De plus, ils ont découvert que, pour le SRAS-CoV-2, les concentrations d’inhibiteurs de GSK3 nécessaires à la modulation de la nucléocapside auraient également activé la signalisation Wnt.

Ainsi, séparer le risque d’activation de la signalisation Wnt avec la modulation de la condensation de la nucléocapside du SRAS-CoV-2 serait difficile. D’autre part, la modulation thérapeutique de la nucléocapside pourrait être viable pour les HCoV tels que NL63 et HKU1, où l’exposition à des médicaments en dessous du seuil d’activation de la signalisation Wnt pourrait être antivirale.

Dans l’écran d’inhibition de la condensation, quatre composés qui ont réduit le nombre de points ponctuels de nucléocapside induits par polyIC par cellule ont été identifiés. Les composés étaient l’acide salvianolique B (SalB), le ponatinib, l’olverembatinib et le bosutinib. Ces composés ont inhibé les deux voies endogènes (formation de granules de stress et translocation nucléaire du facteur régulateur de l’interféron 3) induites lors de la transfection polyIC.

Plusieurs composés identifiés dans cette étude ont été précédemment signalés comme ayant une activité antivirale contre plusieurs HCoV. De plus, la concentration inhibitrice semi-maximale publiée de l’antiviral (IC₅₀) données corrélées avec les concentrations efficaces demi-maximales (EC₅₀) des condensats de nucléocapside déterminés dans cette analyse.

conclusion

En résumé, l’étude a démontré la formation de condensats de nucléocapside pour sept HCoV, qui pourraient être inhibés ou favorisés par de petites molécules. Plus précisément, ils ont identifié les inhibiteurs de GSK3 comme composés de pro-condensation. Les quatre inhibiteurs de condensation pourraient perturber la séparation de phase des nucléocapsides du HCoV via de nombreux mécanismes.

Dans l’ensemble, l’étude a révélé que de petites molécules à potentiel thérapeutique pouvaient moduler la dynamique du condensat de la nucléocapside. L’approche basée sur le dépistage pourrait aider à accélérer la découverte de médicaments pour lutter contre les futures pandémies.

*Avis important

bioRxiv publie des rapports scientifiques préliminaires qui ne sont pas évalués par des pairs et, par conséquent, ne doivent pas être considérés comme concluants, guider la pratique clinique/les comportements liés à la santé, ou traités comme des informations établies