Le coronavirus 2 du syndrome respiratoire aigu sévère (SRAS-CoV-2) a causé d’immenses souffrances et des difficultés économiques à des millions de personnes dans le monde. À ce jour, le mécanisme d’infection par le SRAS-CoV-2 est toujours à l’étude dans le but de développer de nouveaux agents préventifs et thérapeutiques.
A cet effet, une nouvelle étude publiée sur le serveur de préimpression bioRxiv* décrit le rôle clé des protéines membranaires appelées intégrines, présentes dans les épithéliums, dans l’entrée et la propagation du SRAS-CoV-2.
Étudier: L’activation de l’intégrine est une composante essentielle de l’infection par le SRAS-CoV-2. Crédit d’image : Kateryna Kon/Shutterstock.com
Sommaire
Entrée SARS-CoV-2
Les coronavirus comme le SRAS-CoV-2 se lient souvent à l’enzyme de conversion de l’angiotensine 2 (ACE2), qui est un récepteur présent à la surface de nombreux types de cellules, pour entrer dans la cellule hôte. Le SRAS-CoV-2 a une nouvelle substitution sur sa protéine de pointe (S), qui médie l’engagement des récepteurs et l’entrée virale. Cette substitution K403R contient le motif arginine-glycine-acide aspartique (RGD), qui permet au virus de se lier aux intégrines liant RGD.
Cette mutation peut favoriser l’entrée des cellules et, par conséquent, jouer un rôle dans la pathogénicité du SARS-CoV-2. Le récepteur ACE2 a deux sites où la liaison à l’intégrine peut se produire, dont l’un comprend le domaine RGD aux positions 204-206. Le deuxième emplacement de liaison à l’intégrine se trouve à l’extrémité C-terminale de la queue cytoplasmique de la molécule dans la séquence RKKKNKAR.
Il a été rapporté que l’ACE2 se lie à l’intégrine β1 dans l’insuffisance cardiaque chez l’homme, ce qui semble favoriser l’adhésion des cellules médiée par RGD.
Que sont les intégrines ?
Les intégrines sont des protéines membranaires qui s’étendent à travers la membrane cellulaire et sont impliquées dans l’adhésion cellulaire. Les intégrines ont à la fois des sous-unités α et qui peuvent être activées par des voies hautement régulées dans les deux sens.
Les molécules d’intégrine ont trois états qui s’interconvertissent, en fonction à la fois de leur conformation et de leur affinité avec le ligand. Le premier état est un état inactif, courbé-fermé (BCS), avec peu d’affinité pour les molécules de liaison dans la matrice extracellulaire (ECM).
Lorsqu’elle est amorcée, la molécule d’intégrine présente un deuxième état fermé étendu (ECS) avec une affinité quelque peu plus élevée pour la liaison. Troisièmement, l’état ouvert actif et étendu (EOS) a l’affinité de liaison la plus élevée pour les ligands ECM.
Les intégrines doivent interagir avec le cytosquelette, ce qui indique que l’adhésion et la migration cellulaires sont affectées. Ainsi, le changement de conformation d’une molécule d’intégrine peut provoquer l’apparition de signaux cellulaires, ce qui peut augmenter l’affinité et l’avidité de liaison au ligand, entraînant des altérations de l’arrangement cytosquelettique qui permettent l’entrée virale.
La liaison intégrine-ligand est provoquée par des cations métalliques divalents tels que le calcium ou le magnésium, qui interagissent avec le domaine du site d’adhésion dépendant des ions métalliques (MIDAS). Le manganèse (Mn) s’est également avéré interagir avec le domaine MIDAS pour stabiliser la conformation ECS dans des conditions de test.
Des recherches récentes suggèrent que le SRAS-CoV-2 pourrait se lier à plus d’un récepteur en agissant comme un ligand central et en formant ainsi un complexe d’interactions récepteur-ligand conduisant à de multiples signaux. ACE2 peut également faire la même chose via son domaine MIDAS, qui agit de la même manière.
Qu’est-ce que l’étude a trouvé?
Dans la présente étude, les scientifiques ont utilisé le SRAS-CoV-2 inactivé par les ultraviolets afin de travailler avec le virus en dehors des conditions de niveau de biosécurité 3 (BSL3). Ces particules ont été marquées par fluorescence par l’octadécyl rhodamine B (R18), qui est un colorant liposoluble qui pénètre dans la membrane d’enveloppe.
L’expérience a montré que l’activation par les ions Mn accélérait l’entrée virale ; cependant, le nombre final de cellules infectées n’était que 20 % supérieur à celui des témoins. Les scientifiques ont également utilisé les antagonistes des intégrines BTT 3033, ATN-161 et GLPG0187.
Le BTT 3033 se lie près du domaine MIDAS pour stabiliser l’état BCS, tandis que l’ATN-161 est un peptide non RGD qui réduit l’infectiosité du SARS-CoV-2. Troisièmement, GLPG0187 a un large spectre d’antagonisme de l’intégrine RGD.
Lorsque les cellules étaient traitées en présence d’ions Mn, 20 % de cellules supplémentaires étaient occupées par le virus. Cette fraction n’a pas répondu au traitement par le BTT 3033, qui ne se lie pas aux intégrines suite à leur activation par les ions Mn.
Les deux autres antagonistes de l’intégrine n’ont produit aucune différence de liaison après co-traitement avec des ions Mn. Cependant, GLPG0187 rivalise avec le virus plus efficacement que ATN-161, produisant ainsi une meilleure inhibition du SARS-CoV-2. De toute évidence, cela suggère que le SARS-CoV-2 doit se lier à l’intégrine RGD pour entrer dans la cellule, et que l’intégrine doit être dans l’état ECS pour que cela se produise.
Grâce à l’utilisation de la microscopie confocale pour visualiser le virus vivant entrant dans la cellule, les chercheurs ont découvert que les cellules traitées avec GLPG0187 perdaient leur capacité d’adhésion cellulaire, probablement parce que les intégrines ne pouvaient plus médier cette entrée. Le traitement au BTT 3033 a réduit la liaison du virus à la surface cellulaire et a empêché le mouvement du virus vers l’intérieur.
L’inhibition de l’interaction Ga13-intégrine bloque l’entrée des cellules SARS-CoV-2R18
L’activation de l’intégrine commence par la liaison d’une molécule appelée taline à la queue cytoplasmique. Le signal résultant provoque la liaison de l’intégrine, qui est ensuite déplacée vers l’état ECS, au ligand.
Le ligand immobilisé provoque une résistance locale à une force de traction appliquée par le cytosquelette sur la protéine adaptatrice à laquelle se lie l’intégrine. Cette force stabilise la liaison intégrine-ECM.
La liaison au talin provoque une résistance qui conduit à une signalisation de l’extérieur vers l’intérieur. À son tour, cela entraîne le remplacement transitoire de la taline par une sous-unité de protéine G (Gα13), ainsi que la propagation, la rétraction, la migration et l’internalisation des récepteurs cellulaires.
Cellules traitées avec deux peptides myristoylés ; à savoir, les peptides mP6 et mP13, ne permettaient pas l’entrée virale. Ces peptides suppriment l’activation de l’intégrine externe-in médiée par Gα13. Par conséquent, il semble que la liaison SARS-CoV-2-intégrine déclenche cette activation.
Dans l’ensemble, l’incapacité à activer l’intégrine après la liaison au SRAS-CoV-2 empêche l’infection cellulaire. Ici, mP6 n’a pas montré d’inhibition significative, suggérant ainsi que la signalisation médiée par Ga13 est consommable une fois que l’infection est établie et que la réplication virale a commencé. Cependant, mP13 a continué à montrer une efficacité inhibitrice, indiquant ainsi que la signalisation de l’intégrine induite par la taline se poursuit tout au long du cycle de vie viral.
UNE. Modèle de signalisation extérieur-intérieur-extérieur pour l’entrée cellulaire médiée par l’intégrine. Liaison hypothétique du SARS-CoV-2 à l’intégrine β1 initie Gα13 liant au1 queue cytoplasmique, qui stimule la signalisation de l’extérieur vers l’intérieur en l’absence d’une signalisation connue de l’intérieur et de l’extérieur stimulée par un récepteur GPCR. mP6 est un inhibiteur spécifique de Gα13 liant au1 queue cytoplasmique. B. Lectures de fluorescence relative des cellules Vero E6 en suspension après 30 min d’incubation avec le SARS-CoV-2R18 dans le véhicule et 100 μM de cellules traitées avec mP6. C. Imagerie des cellules vivantes du SRAS-CoV-2R18 (magenta) la liaison et l’endocytose montrent la membrane cellulaire et la localisation périnucléaire du SRAS-CoV-2R18 vésicules tandis que le virus reste au niveau de la membrane plasmique dans les cellules traitées avec 50 M de mP6. Plages de LUT affichées dans le coin inférieur gauche des images de point de temps de 6 minutes. Barres d’échelle, 10 m. ré. Traces des valeurs d’intensité absolue de la liaison du virus au cours du temps. Deux cellules représentatives pour chaque condition sont tracées à partir des données acquises le même jour pour permettre une comparaison directe des valeurs d’intensité. A titre de comparaison, les données des cellules traitées fictivement sont les mêmes que dans Figure 4. Les données ont été ajustées à une fonction de régression non linéaire avec des constantes arbitraires à des fins d’apparence. E. Inhibition de l’infection productive par le SRAS-CoV-2. Les cellules Vero E6 en suspension ont été pré-incubées avec 250 M de mP6 et 250 μM de mP13 pendant 30 min et suivies d’une infection avec 0,01 MOI SARS-COV-2 pour une incubation supplémentaire de 60 min. Les cellules ont été lavées deux fois et transférées dans une plaque à 12 puits pendant 48 heures et analysées pour l’ARN viral par RT-qPCR.
Quelles sont les implications ?
La présente étude démontre que les intégrines sont étroitement liées à l’entrée des cellules du SRAS-CoV-2 via l’endocytose. Les antagonistes à large spectre des domaines RGD ont supprimé l’entrée des cellules quel que soit le statut d’activation de l’intégrine.
Cependant, le SARS-CoV-2 se lie aux intégrines BCS, ce qui les stabilise et favorise sa propre endocytose dans la cellule hôte. Le traitement des cellules avec BTT3033, qui est un antagoniste allostérique de l’extension de l’intégrine, s’est avéré efficace pour empêcher l’entrée virale.
« Ainsi, nos données contextualisent l’extension des intégrines en tant que « sine qua non de la fonction d’adhésion cellulaire des intégrines », qui à son tour est une condition essentielle pour l’entrée cellulaire médiée par les intégrines par le SRAS-CoV-2. «
Les intégrines activées et inactives sont traitées différemment par la cellule. Alors que l’intégrine activée qui est liée au SRAS-CoV-2 est acheminée vers la zone périnucléaire par des protéines comme la neuropiline 1 (NRP1), l’intégrine inactive est plutôt recyclée via une protéine adaptatrice différente à la membrane cellulaire. Cela pourrait expliquer comment NRP1, qui se trouve à des niveaux élevés dans la muqueuse olfactive, est capable de médier l’entrée virale, car il se lie aux motifs linéaires courts (SLiM) dans les queues cytoplasmiques de l’ACE2 et des intégrines qui médient l’endocytose.
« Notre étude représente un premier pas en avant dans l’établissement d’un rôle mécaniste pour l’activation de l’intégrine médiée par le SRAS-CoV-2 requise pour l’entrée dans les cellules et l’infection productive. «
*Avis important
bioRxiv publie des rapports scientifiques préliminaires qui ne sont pas évalués par des pairs et, par conséquent, ne doivent pas être considérés comme concluants, orienter la pratique clinique/le comportement lié à la santé, ou traités comme des informations établies.
