La santé mondiale est menacée par de multiples maladies zoonotiques. Les agents pathogènes hébergés par les petits mammifères causent plus de 60 maladies.
Un article récent dans Emerging Infectious Diseases décrit une nouvelle méthode de recherche d’agents pathogènes zoonotiques à partir de tissus animaux archivés dans des musées.
Étude: Prospection d’agents pathogènes zoonotiques à l’aide d’un enrichissement ciblé en ADN. Crédit d’image : ElizavetaGalitckaia/Shutterstock.com
Introduction
Les zoonoses qui ont causé le plus de cas de maladie et de décès dans le monde sont le virus de la rage, Yersinia pestis (Y. pestisauteur de la peste bubonique qui a tué entre un tiers et un cinquième des Européens), le virus Ebola et la tuberculose, ainsi que le syndrome respiratoire aigu sévère coronavirus 2 (SARS-CoV-2) qui a causé la maladie à coronavirus 2019 (COVID -19) pandémie.
Les spécimens d’animaux sont conservés dans les musées d’histoire naturelle. Auparavant, la peau ou les os séchés étaient archivés, ou les tissus animaux fixés au formaldéhyde.
De nos jours, l’azote liquide ou les congélateurs mécaniques sont utilisés pour conserver les échantillons de tissus mous, aidant à récupérer leur ADN et leur ARN.
Ceux-ci peuvent être utilisés pour remonter et détecter les agents pathogènes zoonotiques, comblant ainsi les lacunes de l’histoire naturelle de bon nombre de ces tueurs. De telles études ont montré, dans un cas, la présence du virus Sin Nombre, un hantavirus, dans des échantillons de tissus de rongeurs sauvages prélevés dans le sud-ouest des États-Unis.
Ces spécimens ont été archivés près de deux décennies avant les premiers cas humains.
Une équipe de scientifiques a entrepris de développer une méthode pour identifier la présence de tels agents pathogènes à l’aide des collections de tissus des musées. La façon dont ils ont choisi de se concentrer sur la capture de séquences ciblées à l’aide de l’enrichissement de la sonde.
Ces méthodes sont conçues pour enrichir de petites quantités d’ADN cible à partir d’un fond d’ADN contaminant.”
Dans de nombreux cas, les sondes sont conçues pour détecter quelques agents pathogènes parmi de nombreux. De tels panneaux peuvent être disponibles dans le commerce ou personnalisés.
Cependant, de nombreux ensembles de sondes disponibles peuvent cibler certains agents pathogènes qui peuvent ne pas infecter d’autres hôtes.
Les chercheurs ont produit un panel de sondes biotinylées dans l’étude actuelle avec environ 40 000 sondes d’ARN de 80 paires de bases (pb) chacune. Celles-ci visaient plus de 30 zoonoses causées par différents groupes d’agents pathogènes, notamment des bactéries, des champignons, des helminthes et des protozoaires.
Les agents pathogènes identifiés pourraient être connus ou liés à des microbes connus, exploitant la capacité de la sonde à se verrouiller sur des séquences avec une différence de 10 % dans la séquence génétique par rapport à la correspondance exacte.
Les scientifiques ont utilisé une version de la technique de séquençage ciblé par élément ultraconservé (UCE) afin que l’ADN pathogène puisse être préférentiellement enrichi.
Les appâts biotinylés se lient à des régions conservées du génome, c’est-à-dire des régions qui restent les mêmes entre différents types d’agents pathogènes. Ils sont ensuite exposés à une collection d’ADN qui pourrait contenir de l’ADN pathogène.
Cela permet aux fragments d’ADN pathogène d’être séparés du reste en se liant à la sonde. Ces fragments sont enrichis puis séquencés.
Le rendement final contient des milliers de copies des mêmes locus génétiques avec des mutations ponctuelles qui peuvent aider à tracer la voie phylogénétique ou la population affectée par l’agent pathogène au fil du temps.
Quarante-neuf loci ont été ciblés pour chaque groupe d’agents pathogènes, bien que quelques-uns aient 98 loci.
Les chercheurs ont généré des échantillons de tissus témoins en laboratoire. Il s’agissait de mélanges hôte-pathogène, enrichis ou non en ADN pathogène. Ceux-ci ont été utilisés pour tester la capacité des sondes à sélectionner des locus cibles à des fréquences plus élevées à partir de l’ADN pathogène.
Qu’a montré l’étude ?
Les résultats de l’étude de la sonde ont indiqué sa capacité à enrichir les loci ciblés de l’ADN pathogène d’environ 3 000 à 7 000 fois, selon l’agent pathogène. La plus forte augmentation de la couverture moyenne par locus a été pour Mycobactérie. Le plus bas concernait Plasmodium lieux.
Dans les échantillons de contrôle, près de 43 % de toutes les lectures provenaient d’agents pathogènes de contrôle (Mycobactérie, Plasmodiumet Schistosome) dans l’échantillon témoin enrichi à 1 %. En revanche, les échantillons de contrôle non enrichis à 1 % n’ont donné que 0,03 % de lectures à partir des locus cibles.
Les scientifiques ont assemblé 0 à 23 locus cibles pour chaque groupe d’agents pathogènes dans les échantillons de contrôle, dont la taille varie de 109 à 1 991 pb. Cela les a aidés à produire un arbre phylogénétique pour chaque groupe où ils pouvaient capturer deux locus ou plus.
Les loci résultants étaient des groupes frères des génomes de référence.
Lorsqu’ils ont été testés sur des tissus archivés par un musée, ils ont généré en moyenne 17,1 millions de lectures par échantillon, soit près de 650 millions de lectures pour les 38 échantillons. Plus de 4% des lectures correspondaient à des locus de la base de données, appartenant à 93 genres, mais 78 étaient à moins de 1 000 lectures par échantillon. Bon nombre de ces coups à basse fréquence peuvent être attribuables à des signaux non significatifs.
Bartonelle et Plasmodium ont été trouvés dans 36 des 38 échantillons, mais alors que 18 pièces avaient plus d’un millier de lectures par échantillon, un nombre égal en avait moins de 12. Inversement, Plasmodium lit à une médiane de ~ 160 par échantillon contre ~ 550 pour Bartonelle.
Il y avait 15 genres avec 1 000 lectures ou plus, mais 13 n’ont pas donné deux locus cibles ou plus pour un agent pathogène. Il y avait 16 Bartonelle lectures et un échantillon contenant Paraburkholderia et Ralstonie, respectivement. Le premier avait 3 à 20 loci, le deuxième trois et le troisième huit loci.
Les génomes mitochondriaux ont également été comparés aux lectures de chaque échantillon, bien qu’elles soient relativement peu nombreuses. Malgré cela, les modèles avec 50 lectures mitochondriales ou plus correspondaient aux identifications du musée. Pour les autres échantillons, plus de 85 % des lectures correspondaient au genre correct.
Quelles sont les implications ?
Le panel d’appâts développé et utilisé dans cette étude a enrichi l’ADN pathogène dans l’échantillon de contrôle de 0,03 % à ~ 43 %. L’échantillon de contrôle enrichi a fourni des informations qui ont aidé à tracer la voie phylogénétique pour trois espèces.
Cette découverte indique que l’ensemble de sondes est capable de détecter ces agents pathogènes même à partir de quelques milliers de copies du génome par échantillon.”
Les loci ciblés sont substantiellement enrichis même en présence de grandes quantités d’ADN hôte dans l’échantillon. L’enrichissement est une première étape vers le dépistage des agents pathogènes dans les tissus archivés.
Dans les échantillons archivés par le musée, le processus a généré des phylogénies pour les échantillons contenant trois espèces, Bartonelle, Ralstonieet Paraburkholderia. Plusieurs clades de Bartonelle ont été découverts, correspondant aux interactions hôte-pathogène du monde réel. Les deux autres espèces sont moins sûres de leur identification.
Le panneau d’appâts est redondant et les locus ciblés couvrent une plage de divergences. Cela permet de capturer des locus génétiques à partir de taxons autres que ceux utilisés pour concevoir l’ensemble de sondes, tels que plusieurs espèces de Bartonelle.
Bien que ces résultats soient prometteurs, il reste du travail pour affiner la méthode. L’ADN de l’hôte est toujours présent en grande quantité malgré l’enrichissement des loci ciblés. Deuxièmement, il est relativement cher.
Encore une fois, ces espèces manquées ne peuvent pas être identifiées malgré le ciblage d’agents pathogènes sur un large spectre, ce qui rend les contrôles fictifs essentiels.
Enfin, il existe un compromis entre la sensibilité et l’efficacité de la capture. Cela limite sa capacité à identifier les agents pathogènes s’il y a 3 000 copies de génome ou moins par échantillon.
Bien que des efforts supplémentaires soient nécessaires pour résoudre ces problèmes, nous pensons que l’enrichissement de l’ADN pathogène à partir d’échantillons de tissus de musée est un outil viable qui mérite d’être développé..”
