Dans une récente étude publiée sur bioRxiv* serveur de prétirage, les chercheurs ont étudié le potentiel de la molécule calpaïne-2 (CAPN2) comme cible thérapeutique contre le (coronavirus 2 du syndrome respiratoire aigu sévère (SARS-CoV-2).
Sommaire
Arrière plan
La maladie à coronavirus 2019 (COVID-19) a causé une morbidité et une mortalité considérables dans le monde entier, justifiant le développement d’agents thérapeutiques contre le SRAS-CoV-2. Les auteurs de la présente étude ont précédemment découvert que les molécules inhibitrices de la calpaïne inhibaient efficacement le SRAS-CoV-2 en ciblant le Mpro (protéase principale) enzyme du virus, essentielle au traitement des protéines du SRAS-CoV-2.
À propos de l’étude
Dans la présente étude, les chercheurs ont étendu leur analyse précédente en étudiant caplain-2 comme cible probable pour développer des agents anti-SARS-CoV-2.
Les auteurs avaient récemment criblé des composés antiviraux en utilisant des cellules Vero E6 et le virus recombinant SARS-CoV-2mNeonGreen, dans lequel plusieurs composés ont démontré une efficacité anti-SARS-CoV-2, et les 18 meilleurs résultats ont été validés dans la présente étude. Pour les expériences de validation, des virus rapporteurs de la protéine fluorescente e-verte (eGFP) du virus de la stomatite vésiculeuse recombinante (VSV) codant pour le VSV-G natif ou la protéine de pointe (S) du SRAS-CoV-2 ont été utilisés.
Pour déterminer si le composé MG132 qui ciblait l’hôte CPN2 pouvait inhiber le SRAS-CoV-2, des molécules d’inhibiteur de calpaïne telles que l’ALLN, la calpeptine, l’E-64d et l’inhibiteur de calpaïne III ont été utilisées puisque les molécules inhibent la calpaïne avec des spécificités variables et ciblent la famille des calpaïnes différemment.
Pour évaluer l’implication de CAPN2 dans COVID-19, un knock-out génétique (KO) du gène a été effectué à l’aide de Cas9/CRISPR facilité par le lentivirus (répétitions courtes palindromes régulièrement espacées en cluster) parmi les cellules MA104, qui expriment l’enzyme de conversion de l’angiotensine 2 (ACE2), critique pour l’entrée virale.
En outre, une analyse Western blot a été effectuée pour valider l’efficacité de CAPN2 KO. Les cellules CAPN2 KO et de type sauvage (WT) ont été inoculées avec la protéine SARS-CoV-2 S exprimant le VSV chimérique (VSV-SARS-CoV-2).
Des analyses de plaque standard des infections par le VSV-SARS-CoV-2 ont été effectuées et le moment auquel CAPN2 a exercé des effets proviraux a été déterminé. Les cellules KO et WT ont été inoculées avec VSV-SARS-CoV-2, et le niveau d’acide ribonucléique messager viral (ARNm) a été déterminé 1,0 à 6,9 heures après l’infection (hpi) par réaction quantitative en chaîne de la polymérase à transcription inverse ( RT-qPCR).
En outre, une souche SARS-CoV-2 recombinante avec des mutations S, D614G, E484K et N501Y, a été testée. Des cellules monoclones CAPN2 KO MA104 ont été générées et confirmées par séquençage Sanger. De plus, des tests de liaison à froid classiques du VSV-SARS-CoV-2 ont été effectués pour déterminer si l’adsorption du VSV-SARS-CoV-2 était affectée négativement par le manque de caplain-2, et le clivage potentiel de la protéine S par CAPN2 a été évalué.
Des expériences de co-transfection ont été réalisées à l’aide de cellules de rein embryonnaire humain (HEK) 293 exprimant ACE2 et de la protéine S de souche WA1, avec CAPN2, furine ou TMPRSS2 (sérine protéase transmembranaire 2), des protéases clés rapportées pour cliver la protéine S pour une invasion efficace de l’hôte . Par la suite, l’équipe a récolté les lysats cellulaires et quantifié les intensités de la protéine S entière et du produit clivé, la sous-unité 2 (S2), suivie d’une évaluation des niveaux d’ACE2 dans les cellules CAPN2 KO et WT.
Résultats
Les inhibiteurs de la calpaïne (inhibiteur de la calpaïne III, calpeptine, E-64d et ALLN) ont inhibé efficacement le VSV-SARS-CoV-2 avec une concentration efficace d’inhibition de 50 % (EC50) valeurs <1,5 µM, mais pas Mpro, et à l'opposé, les inhibiteurs de la calpaïne n'ont montré aucune activité antivirale envers les protéines natives de WT VSV. Les infections à VSV-SARS-CoV-2 ont été considérablement réduites parmi les cellules KO calpaïne-2, et CAPN2 était essentiel pour une première étape dans la prolifération du SARS-CoV-2. CAPN2 a favorisé la liaison du SRAS-CoV-2 avec les cellules de l'hôte.
Les découvertes ont indiqué que les molécules d’inhibiteur de calpaïne ciblaient une voie Mpro-indépendante pour inhiber efficacement le SRAS-CoV-2 et la calpaïne-2 en tant que nouveau facteur hôte qui pourrait être potentiellement ciblé à l’étape d’invasion des cellules hôtes pour élargir le paysage thérapeutique du COVID-19 . La plupart des composés antiviraux testés ont démontré une infection dose-dépendante par le VSV et l’inhibition du VSV-SARS-CoV-2 parmi les cellules MA104.
IMBX (3-isobutyl-1-méthylxanthine), nigéricine et brefeldine A ont montré EC50 valeurs inférieures à 2,0 μM contre les infections à VSV et VSV-SARS-CoV-2. Le nitazoxanide a montré une inhibition du SRAS-CoV-2 et le MG132 était 100 fois sélectif en activité contre le VSV et le VSV-SARS-CoV-2 avec EC50 valeurs de 44 et 0,6 µM, respectivement. Aucun inhibiteur, à l’exception de la calpeptine, n’a montré de cytotoxicité. L’ARNm du VSV-SARS-CoV-2 a été réduit de 4,0 fois dans les cellules dépourvues de CAPN2. Les plaques VSV-SARS-CoV-2 mesuraient respectivement 1,0 mm et 2,0 mm dans les cellules KO et WT. Cependant, il n’y avait pas de différences significatives dans la taille des plages de VSV dans les cellules KO et WT.
Les signaux GFP du VSV-SARS-CoV-2 ont été abaissés parmi les cellules knock-out CAPN2 à six hpi, indiquant que CAPN2 a aidé à la réplication du SARS-CoV-2. Des niveaux significativement moindres d’ARNm et de protéine S du VSV-SARS-CoV-2 ont été notés dans les cellules KO par rapport aux cellules WT. Fait intéressant, des niveaux non significativement inférieurs d’ARNm ont été trouvés dans les cellules knock-out CAPN2, indiquant que les effets de CAPN2 sur le SRAS-CoV-2 dépendaient probablement de la nature de la protéine S.
De plus, les niveaux d’ARNm viral dans les cellules KO et WT étaient similaires en présence d’incubation d’anticorps. L’analyse de co-localisation de WGA (agglutinine de germe de blé) et d’ACE2 a démontré des niveaux d’ACE2 de surface significativement moindres parmi les cellules CAPN2 193 KO.
Conclusion
Dans l’ensemble, les résultats de l’étude ont montré que la calpaïne-2 régulait positivement la présence d’ACE2 sur les surfaces cellulaires, améliorant ainsi la liaison à médiation S et l’infectivité du SRAS-CoV-2. Ainsi, CAPN2 pourrait être considéré comme un nouveau facteur proviral facilitant l’entrée de la cellule hôte du SRAS-CoV-2.
*Avis important
bioRxiv publie des rapports scientifiques préliminaires qui ne sont pas évalués par des pairs et, par conséquent, ne doivent pas être considérés comme concluants, guider la pratique clinique/les comportements liés à la santé, ou traités comme des informations établies.
