Dans une récente étude publiée sur bioRxiv* serveur de prétirage, les chercheurs ont évalué l’impact de la voie d’entrée du coronavirus 2 (SRAS-CoV-2) du syndrome respiratoire aigu sévère sur les processus cellulaires et viraux en aval.
Sommaire
Arrière plan
Malgré la variation des protéines SARS-CoV-2 spike (S) parmi les variantes, l’étape d’entrée est cruciale dans le cycle de vie du SARS-CoV-2. L’infection par le SRAS-CoV-2 des cellules hôtes commence par la fixation des cellules via les récepteurs de la lectine de type C. Le virus se lie aux membranes cellulaires et la protéine S se fixe directement au récepteur primaire appelé enzyme de conversion de l’angiotensine 2 (ACE2).
Le clivage de la protéine S expose le peptide de fusion, ce qui facilite la fusion des membranes virales hôtes, créant ainsi un pore qui permet la libération virale dans les cellules hôtes. Ce clivage S se produit en présence de sérine 2 de protéase transmembranaire humaine (TMPRSS2). Par conséquent, les niveaux d’expression de TMPRSS2 ont influencé le mécanisme employé par le virus pour pénétrer dans les cellules exprimant l’ACE2.
À propos de l’étude
Dans la présente étude, les chercheurs ont étudié l’association de la voie d’entrée du SRAS-CoV-2 avec les processus viraux et hôtes en aval physiologiquement pertinents.
L’équipe a développé des plasmides de livraison de transgènes lentiviraux qui codent pour les protéines ACE2 murines ou humaines ainsi que des plasmides de livraison de transgènes lentiviraux qui codent soit une version catalytiquement inactive (ΔHDS), soit une protéine TMPRSS2 fonctionnelle. Des plasmides ont été utilisés pour développer un panel de lignées cellulaires qui s’exprimaient de manière ectopique tandis que l’analyse par Western blot déterminait l’expression murine ou humaine de l’ACE2 dans les cellules A549-A, A549-AT(ΔHDS), A549-AT et A549-mAT.
De plus, la sensibilité à l’infection des lignées cellulaires modifiées ou parentales a été évaluée à l’aide du virus ancestral (B.1) et des variantes préoccupantes (COV) du SRAS-CoV-2 B.1.617 et B.1.1.529.
La sensibilité du virus à l’inhibition de l’entrée dans les cellules épithéliales pulmonaires a été évaluée en effectuant des infections virales authentiques, qui ont été exposées à un inhibiteur de TMPRSS2 appelé mésylate de camostat et à un inhibiteur de cathepsine B/L appelé E-64d.
De plus, l’équipe a évalué si l’incident d’entrée de surface au niveau de la membrane plasmique pouvait être artificiellement stimulé dans les cellules déficientes en TMPRSS2 en effectuant des infections dans des conditions acidifiées.
Résultats
Les résultats de l’étude ont montré que l’expression et l’auto-clivage de TMPRSS2 ont abouti à deux fragments dans les cellules A549-T et A549-AT. L’équipe a observé l’accumulation de TMPRSS2 pleine longueur dans les cellules A549-AT(ΔHDS) qui ne présentaient aucune activité de sérine protéase et d’auto-clivage. Cela n’a confirmé aucune expression endogène de TMPRSS2 ou ACE2 dans les cellules parentales A549.
De plus, la réplication de B.1 a été significativement augmentée dans les cellules A549-AT avec une augmentation modeste des COV. L’amélioration dans les trois souches virales a diminué à des niveaux similaires ou inférieurs à ceux trouvés dans les cellules A549-A en présence de TMPRSS2 inactif. Notamment, l’accumulation des protéines de nucléocapside B.1.1.529 était comparable dans les cellules TMPRSS2 qui surexprimaient l’ACE2 murin ou humain.
Cependant, l’accumulation n’était pas similaire pour les variantes B.1 et B.1.617, ce qui indiquait une large gamme d’hôtes qui utilisaient l’ACE2 murin pour B.1.1.529. De plus, la transcription intracellulaire et la réplication de B.1 et B.1.1.529 ont été remarquablement augmentées dans les cellules A549-AT que dans les cellules A549-AT(ΔHDS) qui n’ont pas été trouvées pour le variant B.1.617.
L’équipe a également noté que les taux de sécrétion de virions étaient considérablement augmentés dans les cellules A549-AT pour B.1, modérément augmentés dans A549-AT pour B.1.617, et imperceptibles dans les surnageants de modérément améliorés dans A549-AT pour B.1.617 et indétectables. 210 dans les surnageants de A549-A et A549-AT pour B.1.1.529. D’autre part, il y avait une sortie significative de B.1.1.529 dans les cellules Vero E6 à des niveaux inférieurs à ceux des variantes B.1 et B.1.617. Cela a montré des différences significatives entre le tropisme des cellules épithéliales pulmonaires et la dépendance à TMPRSS2 parmi différentes souches de SARS-CoV-2.
De plus, le mésylate de camostat a modérément inhibé l’infection par B.1 parmi les cellules A549-AT mais pas dans les cellules A549-A. Notamment, l’infection par B.1.617 n’a été inhibée pour aucun des types de cellules. Cependant, E-64d a remarquablement inhibé l’infection par B.1.617 et B.1 des deux types de cellules.
L’infection B.1 parmi les cellules A549-AT(ΔHDS) a encore diminué dans toutes les conditions par rapport aux cellules A549-A, ce qui indique que TMPRSS2 fonctionnellement inactif a bloqué l’engagement d’ACE2 par encombrement stérique. Ce phénomène n’a pas été trouvé pour la variante B.1.617, ce qui a mis en évidence les variations potentielles de l’engagement de l’ACE2 entre les souches.
La couverture de lecture et la profondeur de séquençage moyenne dans les génomes viraux ont mis en évidence les variations des taux de transcription précoce et de réplication virale trouvées entre les cellules A549-AT et A549-A. Cela a également montré des profils de transcription hautement conservés dans le profil génomique du SRAS-CoV-2, ce qui a confirmé la conservation de l’expression du cadre de lecture ouvert (ORF) ainsi que la cinétique de réplication du génome entre les COV et les souches ancestrales. Au total, les données ont montré que l’expression de TMPRSS2 améliorait les taux d’infection des souches SARS-CoV-2 B.1, B.1.617 et B.1.1.529.
Dans l’ensemble, les résultats de l’étude ont mis en évidence les différences entre les souches SARS-CoV-2 B.1, B.1.617 et B.1.1.529 en ce qui concerne la dépendance à TMPRSS2 et leur corrélation avec l’activation en aval des réponses immunitaires après l’entrée virale.
*Avis important
bioRxiv publie des rapports scientifiques préliminaires qui ne sont pas évalués par des pairs et, par conséquent, ne doivent pas être considérés comme concluants, guider la pratique clinique/les comportements liés à la santé, ou traités comme des informations établies.
