Les troubles cérébraux comme la maladie de Parkinson (MP) ou la maladie d'Alzheimer (MA) commencent à se développer chez les patients beaucoup plus tôt que l'apparition de leurs premiers symptômes cliniques. Traiter les patients à ces stades précoces pourrait ralentir, voire arrêter leur maladie, mais il n’existe actuellement aucun moyen de diagnostiquer les troubles cérébraux à ces stades pré-symptomatiques. Jusqu’à présent, les lésions cérébrales spécifiques provoquées par la MP, par exemple, ne peuvent être détectées qu’en analysant des biopsies cérébrales, qui ne peuvent être obtenues qu’à titre posthume.
Pour surmonter ce goulot d'étranglement critique, les chercheurs ont étudié le nouveau concept de « biopsies liquides », qui implique l'extraction facile de sang ou d'autres fluides corporels à l'aide de procédures non invasives, et leur analyse à la recherche de molécules provenant du cerveau et d'autres tissus solides. Les « vésicules extracellulaires » (VE), de minuscules sacs liés à la membrane libérés par le cerveau et d'autres cellules dans les fluides environnants, sont une cible particulièrement prometteuse dans les fluides corporels. Ces sacs contiennent une variété de molécules qui peuvent être uniques aux types de cellules qui les produisent, comme le cerveau, et pourraient donc également contenir des biomarqueurs protégés pour l'apparition précoce de la maladie de Parkinson et d'autres maladies cérébrales.
Cependant, malgré les progrès récents, les experts en VE n'ont pas été en mesure de résoudre le problème de savoir si les molécules biomarqueurs particulières qu'ils ont mesurées dans des VE isolés sont strictement contenues à l'intérieur des VE ou non spécifiquement liées à leur surface. Ce défi les a en fait empêchés de tirer des conclusions sans ambiguïté sur les molécules cargo présentes dans les véhicules électriques à partir de tous les types de tissus.
Désormais, une équipe collaborative dirigée par David Walt, Ph.D. au Wyss Institute de l'Université Harvard et au Brigham and Women's Hospital (BWH) de Boston a résolu ce problème en ajoutant une étape cruciale à un protocole ultra-sensible déjà validé. En digérant enzymatiquement toutes les protéines liées à la surface d'une population de véhicules électriques purifiée, ils ont pu cibler spécifiquement les marchandises protégées à l'intérieur des véhicules électriques tout en éliminant les « contaminations » non spécifiques. En utilisant leur protocole amélioré pour mesurer le biomarqueur PD ⍺-synucléine dans le sang, ils ont pu pour la première fois déterminer avec précision la petite fraction de toute protéine contenue dans les véhicules électriques par rapport à la quantité présente gratuitement dans le plasma sanguin total.
Surtout, ils ont intégré cette avancée à un test de détection ultra-sensible nouvellement développé pour une forme de ⍺-synucléine qui devient de plus en plus phosphorylée au cours de la progression de la MP et de la maladie associée, la démence à corps de Lewy. En analysant une cohorte d’échantillons de patients, ils ont pu détecter un enrichissement de la protéine pathologique ⍺-synucléine à l’intérieur des EV par rapport au plasma total. Les résultats sont publiés dans PNAS.
« La recherche sur les véhicules électriques dans notre groupe et dans d'autres au cours des dernières décennies a progressivement fait progresser notre compréhension de leur biologie complexe et de leur composition moléculaire. Pourtant, l'isolement des véhicules électriques spécifiques aux tissus purs à partir de fluides corporels comme le sang ou le liquide céphalo-rachidien entourant le système nerveux central. système, y compris le cerveau, et valider et quantifier leur véritable contenu avec des mesures précises présentent encore de formidables défis techniques », a déclaré Walt, membre du corps professoral de Wyss.
Nos travaux récents apportent une solution pour combler cette lacune technologique et nous rapprochent de la possibilité d'obtenir des véhicules électriques exempts de contamination afin de les utiliser comme sources riches en biomarqueurs cliniques, comme nous le montrons avec l'exemple de la ⍺-synucléine phosphorylée. « .
David Walt, Institut Wyss de l'Université Harvard
Walt est directeur pédagogique de l'accélérateur de diagnostic du Wyss Institute, est également professeur Hansjörg Wyss d'ingénierie d'inspiration biologique à la Harvard Medical School (HMS), professeur de pathologie au Brigham and Women's Hospital et professeur au Howard Hughes Medical Institute.
Du sang aux véhicules électriques, en passant par les biomarqueurs et le diagnostic
Particulièrement motivé par la promesse diagnostique des véhicules électriques pour le diagnostic précoce de la maladie de Parkinson, de la maladie d'Alzheimer et d'autres troubles cérébraux, le groupe Walt a systématiquement rempli les pièces vitales de ce puzzle technique. Avec le soutien philanthropique de Good Ventures, de l'Initiative Chan Zuckerberg et plus récemment de la Fondation Michael J. Fox, ils ont précédemment développé un cadre technique pour quantifier les véhicules électriques et ont utilisé cette quantification pour comparer les méthodes d'isolation des véhicules électriques à partir de fluides corporels. Leur méthodologie combine une technique de séparation connue sous le nom de chromatographie d'exclusion de taille (SEC) pour récupérer la plupart des EV à partir de biofluides avec des « tests Simoa » ultra-sensibles qui leur ont permis de compter les molécules protéiques uniques associées aux EV qu'ils ont capturées et visualisées avec des anticorps spécifiques. À l'heure actuelle, l'équipe a conçu des tests Simoa pour une variété de biomarqueurs spécifiques aux véhicules électriques et, surtout, a exclu une protéine de surface candidate largement utilisée, L1CAM, comme cible pour isoler les véhicules électriques spécifiques au cerveau, ce qui a fourni au domaine une correction de cap importante. .
« Pour répondre à la question conceptuellement simple mais techniquement difficile de savoir quel pourcentage d'une protéine donnée (telle que la ⍺-synucléine) présente dans le plasma se trouve à l'intérieur des véhicules électriques par rapport à l'extérieur, nous avons utilisé les méthodes d'isolement SEC que nous avons précédemment développées pour isoler la plupart des véhicules électriques du plasma. ainsi qu'un « test de protection des protéinases » optimisé dans lequel nous utilisons une enzyme pour mâcher doucement mais efficacement toutes les protéines de la surface des véhicules électriques isolés, tout en laissant intact l'intérieur du véhicule entouré d'une membrane. a déclaré le co-premier auteur Dima Ter-Ovanesyan, Ph.D., qui est scientifique principal à l'Institut Wyss et dirige le projet EV avec le co-premier auteur et boursier postdoctoral Tal Gilboa, Ph.D.
En outre, pour mesurer la ⍺-synucléine à des niveaux très faibles, Gilboa, en collaboration avec la boursière postdoctorale Gina Wang, Ph.D. et Sara Whiteman, assistante de recherche de Wyss au laboratoire Walt, ont développé un test Simoa pour la ⍺-synucléine qui est beaucoup plus sensible que tout test précédemment rapporté. En utilisant ce test dans leur protocole, l’équipe a pu déterminer que la majeure partie de la ⍺-synucléine dans les véhicules électriques isolés à l’aide de leur protocole SEC était protégée et que cette quantité représentait moins de 5 % de la ⍺-synucléine totale du plasma sanguin. Comprendre cette quantité est particulièrement important pour l'objectif final de mesurer la ⍺-synucléine dans les véhicules électriques dérivés de neurones, car les véhicules électriques provenant d'un tissu spécifique comme le cerveau devraient être rares par rapport aux véhicules électriques provenant des cellules sanguines, où la ⍺-synucléine est également exprimée. .
Surtout, en plus de leur test Simoa ultra-sensible qui leur a permis de détecter la protéine ⍺-synucléine normale non modifiée, ils ont également développé un test capable de détecter la ⍺-synucléine qui devient phosphorylée sur un site spécifique (pSer129) au cours du processus. de la progression de la MP. « Lorsque nous avons appliqué notre méthodologie avancée à une cohorte d'échantillons de sang obtenus auprès de patients atteints de MP et de démence à corps de Lewy ainsi que de donneurs témoins sains, nous avons constaté que le rapport entre la ⍺-synucléine phosphorylée et la ⍺-synucléine totale était de deux à trois. plier plus haut à l’intérieur des véhicules électriques par rapport à l’extérieur des véhicules électriques », a déclaré Gilboa. « C'était extrêmement excitant car cela suggère que les véhicules électriques pourraient protéger l'état de phosphorylation des protéines des phosphatases en circulation qui, autrement, effaceraient cette marque hautement informative. » L’équipe étudie désormais plus en détail si ces tests pourraient être utilisés pour différencier les patients parkinsoniens des personnes non atteintes de la maladie.
« Les travaux de l'équipe de David Walt représentent un tour de force technologique qui nous rapproche de plus en plus d'une plateforme de diagnostic de nouvelle génération au potentiel extraordinaire. À ce stade, nous ne sommes pas loin d'utiliser ces outils d'origine cellulaire extrêmement riches et révélateurs. vésicules comme une fenêtre permettant d'accéder au cerveau des patients sans nécessiter de chirurgie », a déclaré le directeur fondateur de Wyss, Donald Ingber, MD, Ph.D., qui est également le Professeur Judah Folkman de biologie vasculaire au HMS et au Boston Children's Hospital et au Professeur Hansjörg Wyss d'ingénierie d'inspiration biologique à la John A. Paulson School of Engineering and Applied Sciences de Harvard.
