Les courtes répétitions palindromiques regroupées régulièrement espacées (CRISPR/Cas9) ont transformé les techniques d’ingénierie du génome. De nombreux outils ont été créés pour permettre des perturbations de perte de fonction faciles et efficaces des sites génomiques fonctionnels.
Les éléments du système CRISPR/Cas9 sont injectés de manière exogène dans des cellules humaines pour modifier le génome. L’endonucléase Cas9 exprimée génère une cassure double brin (DSB) dans une région génomique spécifique en présence d’un ARN guide (ARNg) complémentaire du site cible et à côté d’un motif adjacent au protospacer (PAM). Si une matrice d’ADN homologue externe est fournie, la réparation dirigée par homologie est utilisée pour réparer le DSB et induire des mutations ou des insertions de séquences spécifiées.
L’ARN polymérase III (Pol III) reconnaît les motifs de liaison du promoteur interne et transcrit les gènes d’ARNt codés au niveau nucléaire. Pour évaluer l’utilisation des gènes d’ARNt, l’occupation Pol III des gènes d’ARNt est couramment utilisée. De plus, les gènes d’ARNt liés à la Pol III se trouvent dans les zones génomiques euchromatiques avec des histones actives, telles que la triméthylation de l’histone 3 lysine 4 (H3K4me3). Au cours de la traduction, la région anticodon d’une molécule d’ARNt détecte le codon complémentaire d’un ARN messager et attache un acide aminé à la chaîne polypeptidique en développement, faisant de ces molécules d’ARN longues d’environ 73 nucléotides (nt) des molécules adaptatrices physiques.
Dans une étude récente publiée sur le serveur de préimpression bioRxiv*, une équipe de chercheurs a utilisé un système CRISPR/Cas9 pour évaluer l’utilisation de l’ARNt en supprimant deux gènes d’ARNt des génomes du carcinome hyper hépatocellulaire (HepG2) et des cellules humaines de la leucémie myéloïde chronique quasi haploïde (HAP1). Les auteurs ont découvert de nombreuses modifications génomiques inattendues au niveau de la région cible en utilisant une approche améliorée d’enrichissement de la cible basée sur les gouttelettes (Xdrop) suivie du séquençage à lecture longue (LRS) de la technologie Oxford Nanopore Technology (ONT).
Sommaire
La région cible est restée détectable et fonctionnelle dans les clones de délétion Cas9
Les auteurs ont choisi une paire de gènes d’ARNt proches les uns des autres sur le chromosome humain 17 pour évaluer l’efficacité de CRISPR/Cas9 pour éliminer ces gènes. Ils ont conçu des ARNg pour cartographier les régions flanquantes 5′ et 3′ uniques des gènes d’ARNt, car ils appartiennent à l’un des plus grands groupes de gènes à copies multiples, dans lequel les membres individuels de la famille de gènes ont une composition de séquence identique. Pour améliorer l’efficacité de la transfection, deux plasmides Cas9 contenant l’un des deux ARNg et un plasmide de petite taille ont été transfectés dans des cellules HAP1 et HepG2.
Les auteurs ont utilisé la sélection antibiotique pour détecter les cellules transfectées positivement et ont généré des clones dérivés de cellules uniques car le vecteur CRISPR/Cas9 contenait le gène de résistance à la puromycine. Une PCR utilisant des amorces spécifiques à la région flanquante a été utilisée pour confirmer la délétion clonale de la région cible. Lors de l’évaluation par électrophorèse sur gel d’agarose, la taille du résultat de la PCR a indiqué une suppression réussie et son contenu de séquence a été confirmé par séquençage Sanger. Un total de 94 clones unicellulaires HAP1 et 90 HepG2 ont été produits. Une délétion a été trouvée dans 5 clones HAP1 et 17 clones HepG2.
L’utilisation de Xdrop dans les clones de délétion a validé le remodelage génomique de la région cible
Les altérations du génome CRISPR/Cas9 ont récemment été validées à l’aide de la technologie Xdrop. La technique Xdrop a été utilisée pour enrichir les séquences contenant la zone génomique ciblée par CRISPR/Cas9 dans les clones de délétion HAP1 Δt72 et HepG2 Δt15 afin d’évaluer les résultats d’édition sur cible dans les clones de délétion Cas9. Ensuite, les auteurs ont utilisé ONT LRS pour déterminer la composition de la séquence des molécules enrichies en Xdrop. Dans les clones de délétion HAP1 Δt72 et HepG2 Δt15, les auteurs ont obtenu en moyenne 217 000 et 179 000 lectures avec une taille médiane de 4 600 et 5 200 paires de bases (pb). L’enrichissement a été déterminé par la couverture de lecture au locus cible dans chaque clone cellulaire. De fortes baisses de couverture aux deux sites DSB ont été constatées lorsque les lectures ajustées et brutes étaient alignées sur le génome de référence humain, et aucune lecture ne couvrait les deux sites DSB dans ces deux clones de délétion.
Des altérations génomiques ciblées se produisaient fréquemment
Les auteurs ont évalué si des événements d’insertion sur cible se sont produits dans les autres clones HAP1 et HepG2 Δt prévus pour avoir la suppression, afin de déterminer la fréquence approximative des modifications génomiques induites par Cas9. En raison de la longueur inhabituellement longue de l’amplicon, ils n’ont pas été en mesure d’estimer la proportion d’occurrences sur cible par PCR à l’aide d’amorces couvrant les régions flanquantes 5 ‘et 3’, car le contig Xdrop-LRS a révélé l’intégration de séquences génomiques supérieures à 7 900 pb. . En conséquence, ils ont créé une paire d’amorces qui se recombinent dans la région cible. Comme aucun produit de PCR spécifique à la région cible n’a été découvert, les auteurs ont examiné cinq clones HAP1, dont trois portaient la délétion homozygote attendue. Deux bandes ont été observées dans le clone de délétion HAP1 Δt72, indiquant une duplication de la zone cible. Un produit de PCR d’une longueur d’environ 340 pb a été identifié dans le clone de délétion HAP1 Δt19 en plus du clone de délétion HAP1 Δt72, indiquant un changement génomique potentiel sur la cible.
Conséquences
La méthode utilisée dans cette étude démontre que CRISPR/Cas9 peut entraîner l’intégration de fragments d’ADN endogènes et exogènes et également produire des inversions, des duplications et des insertions locales de fragments fonctionnels dérivés de la cible. Bien que des recherches antérieures aient rapporté que lors de l’utilisation du double mécanisme d’ARNg, une région génomique d’intérêt peut être dupliquée ou inversée, cette recherche présente des preuves qu’une combinaison de duplication et d’inversion, ainsi que l’intégration de fragments d’ADN exogènes et de réarrangements interchromosomiques groupés, peuvent se produire simultanément.
De plus, il a été montré pour la première fois que les fragments dérivés de la cible étaient néanmoins fonctionnels malgré ces modifications, ce qui peut compliquer les explications mécanistes. Ces résultats révèlent un nouvel exemple d’occurrences d’édition CRISPR/Cas9 non intentionnelles qui peuvent passer inaperçues et avoir un impact significatif sur les conclusions tirées des lectures expérimentales.
*Avis important
bioRxiv publie des rapports scientifiques préliminaires qui ne sont pas évalués par des pairs et, par conséquent, ne doivent pas être considérés comme concluants, guider la pratique clinique/les comportements liés à la santé, ou traités comme des informations établies.
