Alors que la pandémie de maladie à coronavirus 2019 (COVID-19) continue de se propager dans le monde entier, son pathogène causal, le coronavirus 2 du syndrome respiratoire aigu sévère (SRAS-CoV-2), est surveillé pour l’émergence de nouvelles variantes et biologie virale.
Dans un souci de rentabilité et de rapidité, le séquençage à base d’amplicons du génome viral a été utilisé pour fournir un moyen sensible de surveillance génomique. Une nouvelle pré-impression, qui a été publiée sur le bioRxiv* serveur, montre comment cela peut être modifié pour en faire une source fiable de données génomiques en réduisant le potentiel connu de contamination.
Sommaire
Importance du séquençage du génome
Le séquençage du génome a été entrepris au début de la pandémie afin d’identifier rapidement le virus et de développer des tests diagnostiques précis dans de nombreux endroits. Depuis lors, la surveillance génomique est essentielle pour suivre la diversité, l’adaptation et la transmission virales, qui à leur tour façonnent la politique de confinement viral.
Les grappes et les événements de grande diffusion ont été particulièrement susceptibles d’être identifiés par cette méthode. Cependant, cette utilisation a été dépassée par l’application du séquençage génomique à la surveillance des nouveaux variants préoccupants (COV) et de leur propagation, d’autant plus qu’ils démontrent des changements dans leur comportement biologique.
Séquençage basé sur l’amplicon
Les méthodes de séquençage du génome à base d’amplicons multiplexés ont montré une utilité inhabituelle dans la surveillance génomique de ce virus, par rapport aux techniques de séquençage d’ARN non biaisées à faible amplification. Les fruits sont évidents sous la forme du téléchargement de centaines de milliers de génomes viraux complets au cours de cette année et demie, la plupart par cette approche.
La méthode la plus largement utilisée pour l’amplification du génome spécifique est basée sur un jeu d’amorces en mosaïque à accès ouvert développé par le réseau ARTIC. Le génome amplifié est ensuite séquencé sur des plates-formes Illumina ou nanopores, conduisant à la construction d’une bibliothèque.
Risque de contamination
Le problème majeur avec une forte amplification est le risque inhérent de contamination. La réaction en chaîne par polymérase produit des milliards d’amplicons de SARS-CoV-2 en environ 35 cycles, comprenant une réaction. Certains d’entre eux peuvent être aérosolisés, bien entendu, et contaminer d’autres échantillons.
L’effet de ceci sur les expériences où la sensibilité de la détection virale est mesurée en dizaines de molécules est potentiellement dévastateur. Et elle n’est qu’exacerbée par le fait que près d’une centaine de lots d’échantillons peuvent être traités en parallèle, augmentant le risque d’échange d’échantillons ou de contamination croisée directe.
Le fait que l’on pense déjà que le SRAS-CoV-2 a des niveaux comparativement faibles de diversité virale et une diffusion rapide et extensive rend difficile la distinction entre le modèle génétique identique attendu et celui causé par la contamination. L’impact de ceci sur les études phylogénétiques est évident, tout comme l’importance clinique de l’identification erronée d’une variante chez un patient malade.
Les risques sont énormément multipliés par le fait que des milliers de chercheurs et d’établissements de recherche sont engagés dans la surveillance génomique, au vu des politiques définies par les responsables gouvernementaux de la santé. Avec l’émergence des COV, ce nombre ne fera qu’augmenter, soulignant la nécessité d’une surveillance stricte afin de garantir la validité des données génomiques.
Les spike-ins d’ADN synthétique permettent une identification fiable des échantillons
L’étude actuelle utilise des spike-ins d’ADN synthétique (SDSI), comme base d’une nouvelle méthode d’identification des échantillons, qui peut être adaptée aux techniques de séquençage actuelles. Ces pics sont couramment utilisés dans d’autres méthodes de séquençage d’ARN pour détecter une contamination ou des échanges d’échantillons.
Les chercheurs ont appelé leur approche SDSI + ARTIC. Ils rapportent que son application au séquençage des amplicons permettra une fiabilité accrue des résultats tout en coûtant peu de temps ou de coûts supplémentaires, et peut être utilisée pour étudier l’épidémiologie et les caractéristiques cliniques du virus.
Critères pour les SDSI
Les SDSI utilisés ici ont une séquence de base avec une identifiabilité unique, avec des régions d’amorçage constantes de chaque côté. Avec cette conception, il est possible d’incorporer un autre ensemble d’amorces dans un test PCR multiplex et ainsi amplifier à la fois le SDSI et la cible principale de la réaction.
Les critères essentiels pour ces amorces supplémentaires incluent leur compatibilité avec de nombreuses réactions de PCR différentes, leur spécificité élevée pour l’amplification des SDSI et l’amplification des amplicons SDSI à des taux similaires les uns aux autres et à la cible principale.
Encore une fois, les séquences SDSI de base uniques doivent être distinguables, à la fois les unes des autres et des séquences génomiques les plus couramment attendues dans les laboratoires. Avec cette approche, plusieurs échantillons amplifiés pourraient être traités en parallèle parce que leurs SDSI identifiables s’associent à eux de manière fiable.
Ainsi, chaque échantillon dispose de son propre contrôle interne spécifique pour aider à détecter les échanges d’échantillons. L’association échantillon-SDSI met également en lumière la contamination virale.
Les SDSI utilisés provenaient de Archée pour éviter une fausse détection de variants basés sur des séquences homologues. Ils ont constaté que 43 séquences sur 48 présentaient plus de 75% d’homologie dans le Archée domaine, et le reste à des bactéries rares qui ne sont pas couramment trouvées dans les laboratoires.
Ainsi, ils pourraient être utilisés dans un large éventail d’applications. Les chercheurs ont également observé que chaque SDSI unique n’était probablement pas confondu avec le contenu clinique et n’était pas homologue avec le SRAS-CoV-2 ou Homo sapiens.
L’utilisation de SDSI supplémentaires n’a pas eu d’effet délétère sur l’amplification virale, et les amorces SDSI ne semblent pas être suffisamment similaires pour mal identifier les génomes. Les paires d’amorces SDSI finales avaient une longueur de 24 pb et une teneur en GC de 46%, tandis que celle du génome du SARS-CoV-2 est d’environ 38%.
Avec la taille commune et la région d’amorçage, et le contenu de GC similaire, le taux d’amplification devait être similaire dans tout le spectre des SDSI.
Quels ont été les résultats?
L’étude a démontré l’absence d’amplification non spécifique, comme prévu, même avec de l’ADN complémentaire dans un échantillon sur écouvillon nasopharyngé, étayant l’hypothèse que les SDSI ne sont pas homologues avec ce matériel génomique clinique. La quantité de SDSI ajoutée à chaque réaction de PCR est optimisée pour accorder l’avantage d’amplification et de séquençage aux amplicons SARS-CoV-2 eux-mêmes.
À 1 μl d’un SDSI 1fM, plus de 96% des lectures mappées sur SARS-CoV-2 à des valeurs de seuil de cycle de 20 à 35, tout en obtenant la même couverture génomique. Lorsqu’ils ont testé des SDSI sur un ensemble de 48 échantillons cliniques du virus, ils ont constaté que 47 étaient trouvés uniquement dans l’échantillon attendu.
La seule exception, l’échantillon 47, a montré 4% de lectures à un autre SDSI voisin, indiquant une contamination potentielle du premier par le second. Cependant, il a également été noté qu’il y avait deux variations de nucléotides uniques (SNV) le distinguant de l’échantillon 48, excluant la contamination comme seule source des lectures virales.
Ce cas révèle la prévalence potentielle d’une contamination non détectée et souligne l’importance d’une méthode pour l’identifier. »
Optimiser le protocole
Les chercheurs ont également testé et sélectionné des modifications de la réaction de PCR ARTIC pour améliorer la récupération de génomes complets avec le moins de lectures. Celles-ci comprenaient le doublement des concentrations d’amorces pour les amplicons à faible efficacité et l’augmentation du nombre de cycles à 40, ce qui produisait l’amplification la plus élevée sur une plage de titres viraux avec le moins de potentiel pour des SNV erronés.
La réduction de l’ensemble des réactifs de construction de la bibliothèque a permis d’éviter une amplification inutilement élevée au-delà de la quantité requise pour le séquençage.
Comparaison avec l’étalon-or
Nous avons observé une concordance de séquence presque parfaite en comparant SDSI + ARTIC au séquençage non biaisé, qui a servi d’étalon-or pour générer des génomes viraux sans erreur et pour capturer des souches divergentes de SARS-CoV-2. »
Lorsqu’ils ont été utilisés pour détecter un cluster suspecté de cas causés par une transmission nosocomiale dans une situation réelle, les chercheurs ont pu identifier en toute confiance un cluster d’infection en 52 heures, avec 17/22 génomes complets à plus de 80%. Les génomes incomplets provenaient d’échantillons avec un seuil de cycle inférieur à 30.
Parmi ceux-ci, 11 échantillons provenaient de la grappe et dix présentaient une quasi-identité, indiquant une transmission nosocomiale. Les échantillons restants ont montré une variation significative, indiquant une infection acquise indépendamment.
Quelles sont les implications?
Notre in silico conception a généré des cibles synthétiques robustes tout en atténuant l’homologie de séquence inter-spike-in ainsi que l’homologie avec les réactifs humains, SARS-CoV-2 et de laboratoire courants. Les SDSI peuvent être facilement adoptés par les laboratoires et les plates-formes de toutes tailles avec seulement des changements mineurs aux méthodologies existantes, peu de coût supplémentaire par échantillon (0,006 USD entre nos mains) et aucune interruption ou ajout de temps aux méthodologies de flux de travail standard.. »
L’utilisation des SDSI surmonte le problème clé de la contamination avec le séquençage à base d’amplicon, permettant d’exploiter ses avantages.
Les SDSI permettent la détection de la contamination au sein des lots, ainsi qu’au sein d’un laboratoire au sens large. Plus de cibles peuvent être synthétisées pour des formats plus grands et pour d’autres plates-formes d’amplicon en mosaïque. Il est également suffisamment polyvalent pour être poursuivi avec les nouvelles technologies de séquençage d’amplicon.
Les chercheurs concluent:
Les SDSI pourraient servir d’outil général pour retracer la contamination potentielle dans une pléthore de champs qui utilisent le séquençage génomique basé sur l’amplicon, comme la sécurité alimentaire, l’identification des espèces et l’échantillonnage environnemental.. »
*Avis important
bioRxiv publie des rapports scientifiques préliminaires qui ne sont pas évalués par des pairs et, par conséquent, ne doivent pas être considérés comme concluants, guider la pratique clinique / les comportements liés à la santé, ou traités comme des informations établies.
