Les scientifiques débloquent le pouvoir de lutte contre les virus avec une plate-forme de nanocorps synthétiques

Dans une étude récente publiée dans le Actes de l’Académie nationale des sciences, les chercheurs ont développé une plate-forme entièrement synthétique pour la génération de nanocorps.

Étude: Plateforme entièrement synthétique pour générer rapidement des immunoglobulines bispécifiques tétravalentes à base de nanocorps. Crédit d’image : Adao/Shutterstock.com

Que sont les nanocorps ?

Les produits biologiques sont de plus en plus utilisés pour le traitement ou la prévention des maladies virales. L’un des défis de l’utilisation d’anticorps est l’émergence potentielle de variants viraux résistants, comme en témoignent les variants du coronavirus 2 du syndrome respiratoire aigu sévère (SRAS-CoV-2) qui étaient totalement ou partiellement résistants aux anticorps thérapeutiques.

Les nanocorps reconnaissent les cibles grâce à une seule variable lourde (V_HH) domaine. Les nanocorps peuvent cibler des épitopes inaccessibles aux anticorps plus volumineux, qui nécessitent une lumière variable (V_L) et lourd (V_H) domaines pour former le paratope. Les nanocorps sont généralement obtenus en immunisant des camélidés ; cependant, des plates-formes synthétiques à base de levure et de phage ont également été utilisées pour de novo Découverte.

Monomérique V_HH présente un pouvoir neutralisant modéré; cependant, la mise en tandem d’hétéro ou d’homo-nanocorps peut augmenter leur puissance. Bien que la valeur des combinaisons de nanocorps soit bien connue, la sélection de nanocorps candidats nécessite des informations structurelles a priori ou le criblage de constructions pour des combinaisons synergiques.

Résultats de l’étude

Dans l’étude actuelle, les chercheurs développent et valident une bibliothèque de nanocorps à base humaine en utilisant le SRAS-CoV-2 comme antigène de test. À cette fin, ils ont créé un V synthétique_HH échafaudage en incorporant des mutations dans le V_H 3-23 gène de la chaîne lourde de l’homme. L’ADN codant pour le nanocorps a été transformé en un vecteur d’affichage de surface de levure.

Les nanocorps étaient bien affichés en surface, avec environ 67 % de la bibliothèque présentant un affichage en surface. La bibliothèque a ensuite été validée en utilisant le domaine de liaison au récepteur (RBD) de la protéine de pointe SARS-CoV-2 comme antigène de test. La bibliothèque a été criblée pour les liants RBD en trois cycles de tri cellulaire magnétique (MACS) et cinq cycles de tri cellulaire activé par fluorescence (FACS).

Le séquençage Sanger des clones du cycle final FACS a révélé un enrichissement élevé de la bibliothèque, ce qui a conduit à la récupération de quatre clones uniques. Ces clones ont été exprimés sous forme de nanocorps marqués His seuls ou liés au fragment humain cristallisable (F_C) domaine pour générer une protéine de fusion de nanocorps. Le dosage immuno-enzymatique (ELISA) a vérifié la liaison RBD des quatre nanocorps.

F_c-les nanocorps fusionnés ont été évalués dans un test de neutralisation du pseudovirus SARS-CoV-2. Le nanocorps LM18 a neutralisé le pseudovirus avec une concentration inhibitrice demi-maximale (IC₅₀) de 66 nM.

Par la suite, le nombre de nanocorps enrichis et leurs épitopes RBD cibles ont été déterminés. Un test de compétition de levure a été utilisé pour évaluer la spécificité de l’épitope à l’aide de trois anticorps SARS-CoV-2, dont CR3022 (classe 4), CC12.1 (classe 1) et CC6.30 (classe 2).

La bibliothèque a été étiquetée avec RBD et incubée avec l’un des trois anticorps. Les populations compétitives et non compétitives ont été triées.

Après filtrage, les chercheurs ont identifié 123 nanocorps uniques et attribué des bacs d’épitopes. Parmi ceux-ci, 100 nanocorps présentaient une liaison compétitive avec l’un des anticorps, tandis que 13 étaient non compétitifs.

Six nanocorps étaient en compétition avec CC6.30 et CR3022, tandis que les quatre autres étaient en compétition avec les trois anticorps. Au total, 45 nanocorps ont été sélectionnés pour une validation plus poussée. Parmi ceux-ci, vingt-quatre nanocorps ont été regroupés avec l’épitope compétitif CR3022 de classe 4 (Nb-C4) et 21 ont été regroupés avec l’épitope compétitif CC6.30 de classe 2 (Nb-C2).

Ensuite, l’équipe visait à générer des immunoglobulines bispécifiques tétravalentes à base de nanocorps (bsNb₄-Igs) en remplaçant le V_L et V_H domaines avec deux nanocorps ciblant des épitopes RBD distincts. Les nanocorps ont été joints à la constante lourde 1 (C_H1) et lumière (C_L) domaines. Les constructions bispécifiques étaient basées sur le nanocorps LM18, compte tenu de son étendue de neutralisation.

LM18 était en concurrence avec CC12.1 et CR3022 mais pas avec CC6.30, ce qui implique que les nanocorps de classe 2, qui ne concurrencent que CC6.30, peuvent présenter un engagement RBD biparatopique avec LM18. Les auteurs ont émis l’hypothèse que les nanocorps de classe 4, qui ne concurrencent que le CR3022, pourraient être en mesure de s’engager simultanément avec le LM18.

Des nanocorps avec des profils de liaison et d’exclusion de taille spécifiques à RBD ont été formatés en bsNb₄-Ig avec LM18 comme chaîne légère et nanocorps de classe 2/4 comme chaîne lourde. Treize des 23 Nb-C4/LM18 bsNb₄-Igs et 16 des 20 Nb-C2/LM18 bsNb4-Igs avaient une neutralisation améliorée de 10 à 470 fois par rapport à LM18-F_c construction de fusion.

Les dix bs-Nb les plus puissants₄-Les Ig ont été évaluées pour la neutralisation des pseudovirus variants du SRAS-CoV-2. Initialement, les constructions bispécifiques ont été criblées pour la neutralisation d’un pseudovirus avec des mutations ponctuelles L452R et E484Q uniques. Sept constructions bispécifiques ont neutralisé ces mutants et ont ensuite été testées contre les pseudovirus Beta, Gamma, Kappa et Delta.

Plusieurs Nb-C4/LM18 bsNb₄-Les Ig ont neutralisé tous les pseudovirus variants avec une concentration moyenne inhibitrice de 50 % (IC₅₀) de 0,2 nanomolaire (nM). De plus, différents bsNb₄– Des Ig avec des blocs de construction de classe 2 et 4 ont été testés.

La variante Omicron était résistante au LM18 et à toutes les constructions bispécifiques avec ce nanocorps. Cependant, bsNb₄-Igs avec Nb-C4 sur un bras et Nb-C2-136 sur l’autre ont neutralisé la variante Omicron.

conclusion

Cette nouvelle plate-forme synthétique permet l’incorporation de nanocorps individuels dans un échafaudage de type IgG, les constructions biparatopiques résultantes présentant une neutralisation équivalente aux anticorps canoniques. De plus, cette approche permet une maturation d’affinité supplémentaire de chaque bloc de construction, augmentant ainsi la puissance. Ce flux de travail s’applique à presque toutes les cibles protéiques et fournit un modèle pour le développement de molécules multispécifiques.