Des scientifiques de l’Université de Leipzig, en collaboration avec des collègues de l’Université de Vilnius en Lituanie, ont développé une nouvelle méthode pour mesurer les plus petites torsions et couples de molécules en quelques millisecondes. La méthode permet de suivre la reconnaissance génique des complexes protéiques CRISPR-Cas, également appelés « ciseaux génétiques », en temps réel et avec la plus haute résolution. Avec les données obtenues, le processus de reconnaissance peut être précisément caractérisé et modélisé pour améliorer la précision des ciseaux génétiques. Les résultats obtenus par l’équipe dirigée par le professeur Ralf Seidel et Dominik Kauert de la Faculté de physique et des sciences de la Terre viennent d’être publiés dans la prestigieuse revue Nature Structural and Molecular Biology.
Lorsque les bactéries sont attaquées par un virus, elles peuvent se défendre grâce à un mécanisme qui repousse le matériel génétique introduit par l’intrus. La clé réside dans les complexes protéiques CRISPR-Cas. Ce n’est qu’au cours de la dernière décennie que leur fonction d’immunité adaptative chez les micro-organismes a été découverte et élucidée. À l’aide d’un ARN intégré, les complexes CRISPR reconnaissent une courte séquence dans l’ADN de l’attaquant. Le mécanisme de reconnaissance de séquences par l’ARN a depuis été utilisé pour désactiver et modifier sélectivement des gènes dans n’importe quel organisme. Cette découverte a révolutionné le génie génétique et a déjà été récompensée en 2020 par le prix Nobel de chimie décerné à Emmanuelle Charpentier et Jennifer A. Doudna.
Parfois, cependant, les complexes CRISPR réagissent également à des segments de gènes qui diffèrent légèrement de la séquence spécifiée par l’ARN. Cela conduit à des effets secondaires indésirables dans les applications médicales. « Les causes de cela ne sont pas encore bien comprises, car le processus ne pouvait pas être observé directement jusqu’à présent », explique Dominik Kauert, qui a travaillé sur le projet en tant que doctorant.
Processus à l’échelle nanométrique suivis en détail
Pour mieux comprendre le processus de reconnaissance, l’équipe dirigée par le professeur Ralf Seidel et Dominik Kauert a profité du fait que la double hélice d’ADN de la séquence cible est déroulée lors de la reconnaissance pour permettre l’appariement des bases avec l’ARN. « La question centrale du projet était donc de savoir si le déroulement d’un morceau d’ADN de seulement 10 nanomètres (nm) de long pouvait être suivi en temps réel », explique Kauert.
Pour observer en détail le processus de déroulement, les scientifiques ont dû le rendre visible au microscope. Pour atteindre cet objectif, l’équipe s’est appuyée sur les réalisations de la nanotechnologie de l’ADN, qui peut être utilisée pour créer n’importe quelle nanostructure d’ADN tridimensionnelle. En utilisant cette technique dite d’origami d’ADN, les chercheurs ont construit un bras de rotor d’ADN de 75 nm de long avec une nanoparticule d’or attachée à son extrémité. Dans l’expérience, le déroulement de la séquence d’ADN de 2 nm d’épaisseur et de 10 nm de longueur a été transféré à la rotation de la nanoparticule d’or le long d’un cercle d’un diamètre de 160 nm – ce mouvement peut être amplifié et suivi à l’aide d’une configuration de microscope spéciale.
Avec cette nouvelle méthode, les chercheurs ont pu observer la reconnaissance de séquences par le complexe CRISPR Cascade presque paire de bases par paire de bases. Étonnamment, l’appariement de bases avec l’ARN n’est pas énergétiquement avantageux, ce qui signifie que le complexe n’est lié que de manière instable lors de la reconnaissance de séquence. Ce n’est que lorsque la séquence entière est reconnue qu’une liaison stable se produit et que l’ADN est ensuite détruit. S’il s’agit de la « mauvaise » séquence cible, le processus est abandonné.
Les résultats aideront à sélectionner les séquences d’ARN appropriées
Le fait que le processus de reconnaissance produise parfois des résultats erronés est dû à sa nature stochastique, c’est-à-dire à des mouvements moléculaires aléatoires, comme les chercheurs ont maintenant pu le démontrer. « La reconnaissance des séquences est pilotée par les fluctuations thermiques dans l’appariement des bases », explique Kauert. Avec les données obtenues, il a été possible de créer un modèle thermodynamique de reconnaissance de séquence qui décrit la reconnaissance de segments de séquence déviants. À l’avenir, cela devrait permettre une meilleure sélection des séquences d’ARN qui ne reconnaissent que la séquence cible souhaitée, optimisant ainsi la précision de la manipulation génétique.
Comme les nanorotors conçus sont universels dans leur aptitude à mesurer les torsions et les couples dans des molécules uniques, ils peuvent également être utilisés pour d’autres complexes ou biomolécules CRISPR-Cas.
Les travaux ont été financés par le Conseil européen de la recherche et la Fondation allemande pour la recherche et réalisés en collaboration avec le groupe de recherche du professeur Virginijus Siksnys de l’Université de Vilnius en Lituanie, qui a isolé et fourni les complexes CRISPR utilisés.
