Les scientifiques utilisent l'outil CRISPR pour effectuer des coupes rapides et précises dans le matériel génomique

Dans une série d'expériences utilisant des lignées cellulaires cancéreuses humaines, des scientifiques de Johns Hopkins Medicine ont déclaré avoir utilisé avec succès la lumière comme déclencheur pour effectuer rapidement des coupes précises dans du matériel génomique, en utilisant un scalpel moléculaire appelé CRISPR, et observer comment des protéines cellulaires spécialisées réparent le endroit exact où le gène a été coupé.

Résultats des expériences, publiés le 11 juin dans Science, révèlent non seulement de nouveaux détails sur le processus de réparation de l'ADN, mais sont également susceptibles, selon les chercheurs, d'accélérer et d'aider à la compréhension de l'activité de l'ADN qui cause généralement le vieillissement et de nombreux cancers.

« Notre nouveau système d'édition de gènes permet une coupe d'ADN ciblée en quelques secondes après l'activation. Avec les technologies précédentes, l'édition de gènes pouvait prendre beaucoup plus de temps, voire des heures », explique Yang Liu, Ph.D., stagiaire postdoctoral, membre de Johns Hopkins. Équipe de recherche en médecine.

Le puissant outil CRISPR a, au cours des dernières années, permis aux scientifiques de modifier ou «modifier» facilement les séquences d'ADN et de modifier les fonctions des gènes pour accélérer le rythme de la recherche sur les conditions liées aux gènes.

Adapté d'un système d'édition de gènes naturel présent dans les bactéries, CRISPR utilise de petites séquences de matériel génétique appelé ARN comme une sorte de guide codé pour correspondre et se lier à une séquence spécifique d'ADN génomique dans une cellule.

La molécule CRISPR contient également une enzyme appelée Cas9, qui agit comme le scalpel pour découper la séquence d'ADN.

Ensuite, la cellule utilise ses propres enzymes et protéines pour réparer l'ADN découpé, ajoutant souvent des séquences d'ADN que les scientifiques glissent dans la cellule.

Liu dit que l'étude du processus de réparation de l'ADN a été entravée par une incapacité à endommager l'ADN, par exemple en utilisant CRISPR, d'une manière rapide, précise et « à la demande ».

Pour les nouvelles expériences, les scientifiques ont modifié le complexe CRISPR-Cas9 en concevant une molécule d'ARN sensible à la lumière qui permet au complexe CRISPR de couper l'ADN génomique dans les cellules vivantes uniquement lorsqu'il est exposé à une longueur d'onde de lumière particulière.

L'avantage de notre technique est que les chercheurs peuvent faire en sorte que la machine CRISPR trouve sa cible sans couper prématurément le gène, en retenant son action jusqu'à ce qu'elle soit exposée à la lumière, ce qui permet aux chercheurs d'avoir beaucoup plus de contrôle sur l'endroit et le moment exact où l'ADN est coupé. « 

Roger Zou, MD., PhD., Membre de l'équipe de recherche, Johns Hopkins University

D'autres équipes de recherche ont expérimenté à la fois des médicaments et l'activation de la lumière pour contrôler le calendrier CRISPR, explique Taekjip Ha, Ph.D., professeur éminent Bloomberg de biophysique et de chimie biophysique, biophysique et génie biomédical à l'Université Johns Hopkins, et un chercheur du Howard Hughes Medical Institute .

Les expériences de son équipe diffèrent en améliorant le moment précis des coupes CRISPR et en examinant la vitesse à laquelle les protéines réparent les dommages à l'ADN.

Pour la présente étude, l'équipe Johns Hopkins, dirigée par Ha et Bin Wu, Ph.D., professeur adjoint de biophysique et de chimie biophysique à la Johns Hopkins University School of Medicine, a délivré une impulsion électrique aux cultures de cellules rénales embryonnaires humaines et les cellules cancéreuses osseuses, qui ont ouvert des pores dans la membrane cellulaire et ont permis au complexe CRISPR avec la molécule d'ARN activée par la lumière de glisser dans les cellules.

Ensuite, les scientifiques ont attendu 12 heures pour que le complexe CRISPR se lie à un endroit ciblé sur l'ADN génomique.

Lorsqu'ils ont éclairé les cellules, ils ont suivi le temps nécessaire au complexe CRISPR pour effectuer la coupe.

L'équipe a découvert que dans les 30 secondes suivant la mise en lumière des cellules, le complexe CRISPR avait coupé plus de 50% de ses cibles.

Pour examiner davantage le moment de la réparation de l'ADN, les scientifiques de Johns Hopkins ont suivi le moment où les protéines impliquées dans la réparation de l'ADN se sont accrochées aux coupes d'ADN.

Ils ont déterminé que les protéines de réparation ont commencé leur travail dans les deux minutes suivant l'activation de CRISPR, et la réparation a été terminée dès 15 minutes plus tard.

« Nous avons montré que la coupure de gène activée par la lumière est très rapide et qu'elle a des applications potentiellement étendues dans la recherche biomédicale. » dit Ha.

« Révéler le moment des coupes des gènes CRISPR nous permet de voir les processus biologiques de manière beaucoup plus précise. » Ha et l'équipe Johns Hopkins ont surnommé la technique «CRISPR très rapide sur demande».

Ha a également noté que l'activation de la lumière offre un meilleur contrôle de la localisation que les médicaments qui peuvent se diffuser largement dans la cellule.

L'équipe de Johns Hopkins a également utilisé des microscopes à haute résolution pour « voir » comment les protéines de réparation interagissent avec le site de coupe CRISPR dans les cellules vivantes.

Ils ont utilisé ces microscopes et un faisceau de lumière focalisé pour montrer qu'ils pouvaient activer la coupure CRISPR de l'une des deux copies de gènes que l'on trouve normalement dans les cellules humaines.

Cette capacité, disent-ils, offre des possibilités d'utilisation de CRISPR pour étudier et éventuellement traiter des conditions liées à une seule copie génétique anormale, comme la maladie de Huntington.

« Il existe une grande communauté de chercheurs intéressés à étudier les dommages à l'ADN et leur impact », explique Ha. « La technologie que nous avons développée est bien adaptée pour étudier cela. »

Ha note que les scientifiques utilisent généralement des rayonnements ionisants ou des produits chimiques pour étudier les dommages à l'ADN. Bien que ces méthodes puissent également être rapides, dit-il, elles ne sont pas spécifiques à un certain emplacement génomique.

L'équipe a déposé un brevet provisoire sur la technologie CRISPR décrite dans cette recherche.