Dans une récente étude publiée sur bioRxiv* serveur de prétirage, les chercheurs ont conçu une plate-forme d’affichage de surface de mammifères à base de lentivirus combinée à un balayage mutationnel profond (DMS) pour évaluer l’impact des mutations de la protéine nucléocapside (N) du coronavirus du syndrome respiratoire aigu sévère 2 (SRAS-CoV-2) sur les performances de tests antigéniques rapides.
Des tests fréquents et généralisés du SRAS-CoV-2 sont essentiels pour freiner la pandémie de maladie à coronavirus 2019 (COVID-19). Les tests antigéniques rapides qui détectent les protéines SARS-CoV-2 N sont les tests de diagnostic de choix dans plusieurs contextes en raison de leur facilité d’utilisation et de leur délai d’exécution court. Cependant, l’émergence sans précédent de variantes du SARS-CoV-2 a soulevé des inquiétudes majeures concernant les performances des tests contre les variantes mutantes.
Sommaire
À propos de l’étude
Dans la présente étude, les chercheurs ont développé une plate-forme d’affichage de surface de mammifère qui permet une mesure quantitative et directe de la liaison des anticorps avec le SRAS-CoV-2 N. La plate-forme a été utilisée avec le DMS pour évaluer la vulnérabilité des tests antigéniques rapides au SRAS-CoV-2 mutations N.
Pour l’analyse, 17 anticorps ayant reçu une autorisation d’utilisation d’urgence (EUA) de la Food and Drug Administration (FDA) utilisés dans les tests antigéniques rapides SARS-CoV-2 actuels ont été utilisés. Deux bibliothèques DMS contenant presque toutes les mutations de la protéine N ont ensuite été emballées dans des particules lentivirales pour la transduction de cellules 293 de rein d’embryon humain (HEK293).
Une construction d’expression a été générée, qui contenait une protéine N encadrée par un peptide signal N-terminal (SP) et une région transmembranaire C-terminale (TM), qui étaient dérivés de l’immunoglobuline G4 (IgG4) et du récepteur du facteur de croissance dérivé des plaquettes (PDGFR ), respectivement. Un régulateur principal de l’entrée du cycle cellulaire et du métabolisme prolifératif (Myc)-tag a été inséré entre la protéine N et SP pour contrôler les différences d’expression des protéines.
La construction a été clonée dans un plasmide exprimant un lentivirus suivi d’une protéine fluorescente verte (GFP). Les cellules Myc+ et GFP+ ont été soumises à une analyse par cytométrie en flux. De plus, des expériences d’interférométrie de biocouche (BLI) ont été réalisées. Dans DMS, les codes à barres de chaque échantillon ont été comptés pour déterminer les scores d’échappement pondérés (Ew), qui reflètent la mesure dans laquelle la liaison des anticorps a été réduite par une mutation particulière.
Pour une validation DMS plus poussée, le clonage des mutations d’échappement de trois anticorps (C706, R040 et 3C3) ayant différents types et emplacements d’épitopes a été effectué. La liaison de l’anticorps aux mutations ponctuelles a été évaluée par des expériences de titrage d’anticorps.
Résultats
Sur 7 942 mutations de la séquence entière de la protéine N, les bibliothèques DMS #1 et #2 comprenaient respectivement 7 893 et 7 901 mutations. Tous les 17 anticorps présentaient des profils de mutation d’échappement distinctifs dans le domaine de dimérisation de la protéine N (NDD), et la plupart des mutations N n’affectaient pas la liaison de l’anticorps.
L’épitope linéaire de R040 était confiné à une étendue continue d’acides aminés entre les résidus d’acides aminés L394 et F403, et la mutation D399N présentait un E élevéw pour l’anticorps. D’autre part, les épitopes 3D des anticorps 3C3 et C706 étaient caractérisés par des étendues discontinues d’acides aminés avec des degrés variables d’échappement mutationnel. Toutes les mutations d’échappement testées pour les anticorps C706 (F110S, G85K, R149D et G116R) et R040 (D399N, D402V et L395V) ont aboli la liaison des anticorps, tandis que les mutations en dehors de l’épitope n’ont eu aucun effet. Pour l’anticorps 3C3. Les mutations V324E et E323V ont aboli la liaison, tandis que les mutations P326A et T329G ont réduit l’affinité de liaison. Les sites d’échappement étaient situés dans le noyau hydrophobe du domaine de liaison au récepteur SARS-CoV-2 N (RBD) et ont probablement déployé ce domaine.
Les expériences de titrage avec des mutants de protéines 3C3 et N ont montré que les scores d’échappement étaient affectés par une disponibilité réduite d’épitopes conformationnels et par des réductions des affinités de liaison des anticorps et que même si les signaux de liaison totaux des anticorps étaient réduits, l’affinité de liaison restait inchangée.
Les épitopes de N-RBD ont été regroupés en quatre classes. Des épitopes de classe I ont été identifiés pour C524, MM08, 1A7 et RC17604 et étaient liés à des sites de boucle situés entre les résidus K143 et Y123 et sur le NDD opposé à l’épingle à cheveux bêta (β). MM05 définissait les épitopes de classe II et sa région de liaison était située dans la boucle en épingle à cheveux β aux positions D98, M101 et K95. Les mutations d’échappement des épitopes de classe III et des épitopes de classe IV étaient situées dans les régions de la boucle C-terminale entre V158 et A173 pour la classe III et entre R149 et P151 pour les épitopes de classe IV.
Des sites d’échappement secondaires ont également été observés pour quelques anticorps (N-Ab3, Ab166, 1C1, 1A7 et R004) à l’extrémité N-terminale de la protéine N dans les résidus S2 à P6. De plus, l’anticorps monoclonal-1 (mAb-1) et le mAb-2 utilisés dans le test commercial d’antigène rapide Clip COVID étaient liés au N-RBD avec une affinité comparable à MM08 et R004, respectivement. La détection de sites d’échappement secondaires et des résultats comparables avec les tests antigéniques rapides commerciaux mettent en évidence la précision du DMS.
La mutation D399N présentait un E élevéw, alors que toutes les autres mutations présentaient un faible Ew, indiquant que les variants du SRAS-CoV-2 contenant ces mutations n’ont pas affecté les performances des tests antigéniques rapides utilisant les anticorps. Outre D399N, D3L, présent dans la variante B.1.1.7, était la seule mutation avec un E légèrement élevéw pour les anticorps Ab166, 1C1 et 3C3 et pourrait affecter leurs performances de test.
Conclusion
Dans l’ensemble, les résultats de l’étude ont montré que les tests antigéniques rapides avec l’approche DMS pouvaient identifier avec précision les mutations d’échappement des anticorps dans la protéine SARS-CoV-2 N. L’approche a pu recenser les emplacements des mutations d’évasion et déterminer comment les mutations ont affecté l’identification d’anticorps. DMS a fourni une carte complète des épitopes des anticorps et de leur susceptibilité à l’échappement mutationnel.
*Avis important
bioRxiv publie des rapports scientifiques préliminaires qui ne sont pas évalués par des pairs et, par conséquent, ne doivent pas être considérés comme concluants, guider la pratique clinique/les comportements liés à la santé, ou traités comme des informations établies.
