La transcription inverse par réaction en chaîne par polymérase en temps réel (RT-qPCR) a été décrite comme l’étalon-or pour la détection du coronavirus 2 du syndrome respiratoire aigu sévère (SRAS-CoV-2). Bien que le processus n’ait pas été conçu à l’origine à des fins de diagnostic, la nécessité de la situation a conduit à une optimisation et a abouti à plusieurs procédures très fiables pour détecter l’infection.
Étude : La RT-qPCR à lyse directe du SARS-CoV-2 dans le surnageant de culture cellulaire permet une quantification rapide et précise du virus, ouvrant ainsi une vaste gamme d’applications. Crédit d’image : Corona Borealis Studio/Shutterstock
Des chercheurs de l’Université d’Édimbourg ont exploré des moyens d’optimiser davantage ce processus, permettant à la RT-qPCR de fonctionner plus efficacement en éliminant l’une des étapes clés.
Une version préimprimée de l’étude est disponible sur le site bioRxiv* serveur pendant que l’article est soumis à une évaluation par les pairs.
L’étude
Les chercheurs ont commencé à utiliser la 1-Step-RTqPCR avec détection de colorant fluorescent, qui est actuellement la méthode la plus rentable. Des paires d’amorces largement utilisées par les Centers for Disease Control (CDC) et le Centre allemand de recherche sur les infections (DZIF) pour détecter le SRAS-CoV-2 ont également été sélectionnées pour l’optimisation.
Tout d’abord, le protocole standard du fabricant a été testé, en suivant des procédures et des recommandations de base. Chaque paire d’amorces testée a montré une augmentation d’environ 5 fois de la sensibilité, avec des augmentations similaires de l’efficacité. Malheureusement, l’utilisation des conditions standard avec CDC N1, DZIF N et RdRp a systématiquement conduit à la formation de dimères d’amorces. L’augmentation des concentrations de N2 a réduit la formation de dimères d’amorces mais n’a pas complètement éliminé la formation de ces dimères.
Les amorces DZIF N ont également formé des produits plus gros que prévu, et le séquençage a révélé la circularisation ou la multiplication d’une section du produit. Une augmentation de la température de recuit n’a pas réduit cela. L’efficacité de l’amorce DZIF N n’a pas dépassé 78,24%, le DZIF RdRp au-dessus de 89,61 %. L’amorce CDC N3 a donné les meilleurs résultats à 93,14 %.
La lyse thermique a d’abord été testée pour libérer l’ARN viral du milieu de production de virus (surnageant de culture virale, ou VPM). Malheureusement, la libération d’ARNv était limitée, correspondant à peu près à une perte de sensibilité de 1000 fois.
Suite à cela, les chercheurs ont tenté d’utiliser des tampons de lyse à la place, en basant tous les tampons sur une solution de NaCl 150 mM, Tris-Hcl 10 mM (7,5pH) complétée par des détergents de lyse, notamment Triton X-100, IGEPAL-620 ou Tween-20. Tous ces éléments ont également été complétés par de la RNasine, un inhibiteur d’ARN. Un traitement à la protéinase K a également été ajouté pour évaluer s’il pouvait améliorer la libération d’ARNv.
Tous les tampons de lyse ont montré des sensibilités similaires, mais les tampons Tween et Triton ont altéré la réaction qPCR. Lorsque les tampons de lyse détergents ont été testés avec de la chaleur et de la protéinase K pour l’ARNv, une augmentation de 1,22-1,37Cts a été observée. Cette augmentation était plus élevée pour le Triton X-100 à 10 %, où la digestion par la protéinase K a entraîné une perte de 5,86 Ct. Les chercheurs ont décidé de continuer avec le tampon IGEPAL-630 pour une optimisation supplémentaire, car il a des niveaux de sensibilité similaires aux autres tampons à des concentrations plus faibles.
L’essai de différentes concentrations du tampon IGEPAL-630 a montré une diminution de l’efficacité à des concentrations plus élevées, mais la concentration la plus faible, 2,5%, a montré une inactivation complète dans les surnageants cellulaires. Aucune diminution significative de la sensibilité n’a été observée pour la réaction de RT-PCR à cette concentration, mais l’efficacité a été affectée.
Les chercheurs ont effectué d’autres expériences pour déterminer pourquoi les sensibilités RPM RT-qPCR à lyse directe étaient inférieures à celles de l’ARNv extrait. Ils ont préparé des séries de dilutions 10 fois de matrices d’ARN. Seule une légère perte d’efficacité a pu être observée sur la courbe de dilution, et les Cts ont augmenté en moyenne de 8,75 cycles pour toutes les concentrations dans les échantillons impliquant des milieux. L’incubation dans le tampon ou le milieu IGEPAL-630 augmente également le Ct, augmentant si les échantillons ont été incubés dans les deux.
L’ajout de RNasin a sauvé la diminution de sensibilité que cela a provoquée. Une enquête plus approfondie a révélé que l’inhibition de la PCR ne s’est produite que dans des échantillons incubés dans des milieux « usés » et non dans des milieux frais. La bétaïne est connue pour améliorer l’amplification PCR en relaxant les structures secondaires, mais lorsqu’elle est ajoutée, elle diminue considérablement l’efficacité ou diminue le signal à des concentrations plus faibles. La sensibilité n’a pas été affectée. L’augmentation de la concentration en amorces n’a pas non plus amélioré la sensibilité.
Enfin, les scientifiques ont testé l’effet de quantités accrues de lyase sur la réaction pour découvrir que cela réduisait considérablement l’efficacité et la sensibilité. En réponse, ils ont essayé de diluer le lysat dans la réaction avec NF-H2O. L’abaissement de la concentration de lysat de VPM a considérablement amélioré la sensibilité et la précision par rapport à l’ARNv à des quantités similaires n’a montré aucune différence significative.
Conclusion
Les auteurs soulignent que le protocole de lyse directe qu’ils ont développé permet une RT-qPCR en une étape à partir du surnageant de culture cellulaire, obtenant des résultats similaires à ceux observés en utilisant des méthodes plus traditionnelles qui nécessitent une purification de l’ARNv. Cela fonctionne bien avec le SRAS-CoV-2 et pourrait aider les laboratoires d’essais et de recherche du monde entier à produire des résultats plus rapidement, contribuant ainsi à mettre fin à la pandémie qui a duré plus de deux ans.
*Avis important
bioRxiv publie des rapports scientifiques préliminaires qui ne sont pas évalués par des pairs et, par conséquent, ne doivent pas être considérés comme concluants, orienter la pratique clinique/le comportement lié à la santé, ou traités comme des informations établies
