Dans une récente étude publiée sur bioRxiv*, les chercheurs ont démontré une nouvelle stratégie pour détecter le coronavirus 2 du syndrome respiratoire aigu sévère (SRAS-CoV-2) à l’aide de nanocorps immobilisés par la chitine.
Sommaire
Arrière plan
requin et Camélidés-les nanobodies dérivés sont des alternatives émergentes aux anticorps traditionnels. Les nanocorps se lient aux ligands dans la gamme nanomolaire et restent stables dans des conditions de stress induites par la chaleur/les produits chimiques, ce qui en fait des candidats prometteurs pour des tests antigéniques à grande échelle. De nombreux nanobodies anti-SARS-CoV-2 ont été conçus par phage display ou par immunisation de lamas, de requins et d’alpagas.
La forme microbienne de Ustilago maydis (champignon du charbon du maïs) peut être exploité pour synthétiser des protéines hétérologues telles que des nanocorps. Récemment, les auteurs ont établi une preuve de principe pour la synthèse de nanobodies anti-SARS-CoV-2. De plus, le mécanisme de sécrétion non conventionnel utilisé par U. maydis pour exporter la chitinase Cts1 peut être mise à profit pour la sécrétion de protéines cibles hétérologues. Cts1 a une activité de liaison à la chitine et peut donc être exploitée comme étiquette d’immobilisation et de purification intrinsèque. Jps1, le facteur d’ancrage nécessaire à la sécrétion de Cts1, peut être un vecteur alternatif.
L’étude et les conclusions
Dans la présente étude, les chercheurs ont établi une nouvelle approche pour détecter le SRAS-CoV-2 à l’aide de nanocorps immobilisés à la chitine. Tout d’abord, ils ont criblé différentes protéines de fusion nanobody-Cts1 pour l’expression, la sécrétion non conventionnelle et l’activité de liaison contre le domaine de liaison au récepteur (RBD) du pic SARS-CoV-2. Quatre constructions de fusion nanocorps-Cts1 ont été synthétisées à l’aide de deux nanocorps dérivés de lama (VHHE et VHHV) et deux nanocorps synthétiques (Sy15 et Sy68).
De plus, un nanocorps bivalent a été généré en appariant VHHV avec VHHE pour donner le VHHVE nanocorps. De plus, le bivalent VHHEE nanobody a été produit pour tester la capacité de liaison des dimères. Les versions de nanocorps publiées Sy68/15-Jps1 et Sy68/15-Cts1 étaient des témoins. L’expression/sécrétion des protéines de fusion cibles a été examinée via des Western blots.
Les surnageants de culture ont montré une sécrétion suffisante de Sy15-Cts1, VHHV-Cts1, VHHE-Cts1, Sy68/15-Jps1 et VHHEE-Protéines de fusion Cts1. L’activité de liaison RBD a été évaluée à l’aide d’un dosage immuno-enzymatique direct (ELISA) d’extraits cellulaires contenant des protéines de fusion nanobody-Cts1. VHHEE-Cts1 et Sy68/15-Jps1 a montré la liaison la plus forte à RBD, alors que VHHE-Cts1 présentait environ la moitié de l’intensité du signal. Les protéines de fusion restantes manquaient d’activité de liaison claire.
De plus, ces trois protéines de fusion ont été purifiées et évaluées dans un ELISA direct contre la protéine SARS-CoV-2 S1 pleine longueur. Les trois protéines de fusion ont montré une activité de liaison significative ; VHHEE-Cts1 et Sy68/15-Jps1 avait une liaison deux fois plus élevée que VHHE-Cts1. Les chercheurs ont effectué des tests de neutralisation ajustés pour déterminer si in vitro activité traduite en in vivo liaison ou neutralisation.
VHHE-Cts1 manquait d’activité neutralisante, tandis que VHHEE-Cts1 et Sy68/15-Jps1 a montré une activité de neutralisation du virus. Étant donné que Cts1 peut se lier à des surfaces recouvertes de chitine telles que des billes magnétiques de chitine, cette caractéristique pourrait être exploitée pour développer une nouvelle stratégie de test d’antigène. La liaison de la chitine a été récapitulée sur des billes de chitine à l’aide de Cts1 recombinant purifié. Des billes de chitine ont été mélangées avec du Cts1 recombinant, ce qui a confirmé la liaison de la protéine recombinante à la chitine.
La protéine de fusion β-glucuronidase (Gus)-Cts1 a été utilisée pour quantifier les résultats. La protéine de fusion Gus-Jps1, qui devait ne pas se lier à la chitine, a servi de témoin négatif. Des billes de chitine ont été recouvertes de protéines de fusion Gus-Cts1 ou Gus-Jps1. Seule la protéine de fusion Gus-Cts1 était liée aux billes de chitine, corroborant la capacité de liaison des protéines de fusion Cts1 N-terminales.
La quantification des intensités de signal a révélé que 44 % de la protéine recombinante Cts1 et 68 % de la protéine de fusion Gus-Cts1 étaient capturés sur la bille. La fonctionnalité de la protéine de fusion après immobilisation (sur billes) a été évaluée. Plus précisément, l’activité Gus a été détectée sur des billes incubées avec des extraits cellulaires contenant Gus-Cts1, ce qui implique une rétention d’activité fonctionnelle (enzymatique) malgré l’immobilisation sur des billes.
Enfin, des dosages d’immunosorbants en sandwich ont été effectués sur des plaques ELISA et des billes de chitine pour évaluer la capacité de VHHEE-Cts1 et VHHE-Protéines de fusion de nanocorps Cts1. Oui68/15-Jps1 était le contrôle dans les deux tests, étant donné qu’il devrait montrer une activité en ELISA mais pas sur des billes de chitine. Les protéines de fusion purifiées ont été enduites sur des plaques ELISA, incubées avec du RBD recombinant dilué en série et détectées par un anticorps anti-RBD et un conjugué de peroxydase de raifort apparenté (HRP).
Alors que les trois protéines de fusion de nanocorps pourraient capturer RBD dans des plaques ELISA, seul Sy68/15-Jps1 et VHHEE-Cts1 a montré une activité volumétrique pour des dilutions en série de RBD. VHHEE-Cts1 a présenté l’événement de liaison le plus fort à la plus faible concentration de RBD. Des billes de chitine ont été incubées séparément avec les trois protéines de fusion de nanocorps et mélangées avec du RBD. Les deux VHHEE-Cts1 et VHHE-Cts1 a conservé une activité de liaison, alors que Sy68/15-Jps1 manquait d’activité sur les billes de chitine. Comme les découvertes précédentes, VHHEE-Cts1 a montré une activité deux fois plus puissante que VHHE-Cts1.
La capacité de capture de RBD de ce système de détection à base de chitine a été caractérisée en déterminant l’activité de liaison volumétrique à l’aide de la protéine de fusion de nanocorps la plus puissante (VHHEE-Cts1). Des billes de chitine ont été chargées de VHHEE-Cts1 et incubé avec du RBD recombinant dilué en série. L’activité a été détectée avec un sandwich d’anticorps commercial. Les chercheurs ont observé une réaction colorimétrique en deux minutes, avec son intensité proportionnelle aux concentrations de RBD.
conclusion
Pour résumer, l’étude a réalisé la sécrétion médiée par Cts1 de nanocorps mono- et bivalents contre le SRAS-CoV-2. Il a fourni une preuve de principe pour un test d’antigène SARS-CoV-2 basé sur la chitine, facilité par le mécanisme de sécrétion non conventionnel de Cts1 dans U. maydis. Les auteurs ont vérifié l’applicabilité des protéines de fusion nanobody-Cts1 dans la détection et la neutralisation de virus invivo. Ceci a confirmé que le nanobody pourrait gripper au virus infectieux, sans compter que la pointe RBD. Les auteurs pensent que cette stratégie pourrait être transformée en une méthode de laboratoire sur puce pour le test de l’antigène SARS-CoV-2.
*Avis important
bioRxiv publie des rapports scientifiques préliminaires qui ne sont pas évalués par des pairs et, par conséquent, ne doivent pas être considérés comme concluants, guider la pratique clinique/les comportements liés à la santé, ou traités comme des informations établies.
