La lumière – et toutes les vagues – peuvent se plier aux coins des obstacles trouvés sur son chemin. En raison de ce phénomène, appelé diffraction, il est impossible de focaliser la lumière sur un point inférieur à la moitié de sa longueur d’onde. En d’autres termes, la résolution la plus élevée que l’on puisse théoriquement atteindre à l’aide d’un microscope optique est d’environ 250 nm, une barrière appelée limite de diffraction. Malheureusement, cette résolution n’est pas suffisante pour observer des structures cellulaires fines, telles que celles trouvées dans les neurones.
Pendant plus d’un siècle, les microscopistes ont été paralysés par cette barrière classique jusqu’à l’invention de la microscopie à fluorescence à super-résolution. Une approche particulièrement puissante a été développée à la fin des années 1990 et a inventé la microscopie à déplétion par émission stimulée (STED). Cette technique nécessite que l’échantillon cible contienne des fluorophores, qui sont des composés qui absorbent la lumière à une longueur d’onde et la réémettent ensuite à une longueur d’onde plus longue.
Dans la version la plus simple de la microscopie STED, les fluorophores sont excités dans un spot circulaire par irradiation avec un laser focalisé à diffraction limitée. Ensuite, une partie en forme de beignet autour du spot est irradiée avec une lumière moins énergétique – le faisceau d’appauvrissement – qui éteint la fluorescence par le processus d’émission stimulée. Ainsi, l’effet net est que seuls les fluorophores au centre du beignet réémettent des photons, et parce que cette zone peut être arbitrairement petite, cela permet une microscopie à super-résolution.
Bien que la microscopie STED ait été une véritable percée pour observer la morphologie des neurones vivants à une résolution plus élevée, il y a encore place à l’amélioration. Dans une étude récente publiée dans Neurophotonique, une équipe de scientifiques dirigée par le Dr U. Valentin Nägerl de l’Université de Bordeaux a développé une méthode d’étalonnage simple mais efficace qui permet une imagerie STED plus précise à des profondeurs tissulaires plus élevées. Leur approche est basée sur l’analyse et la correction d’une des principales sources d’erreur systématique en microscopie STED pour les échantillons biologiques : l’aberration sphérique du faisceau de déplétion.
Lors de l’imagerie d’un échantillon de tissu à des profondeurs supérieures à 40 m, le faisceau d’appauvrissement subit divers types de défocalisation et de dégradation (aberration) et perd sa forme soigneusement conçue, ce qui est essentiel à la méthode STED. L’aberration sphérique est le plus grand délinquant et était celui que les chercheurs ont ciblé. Leur stratégie consistait à préparer d’abord un échantillon fantôme de tissu cérébral, un proxy à base de gel avec un indice de réfraction similaire à celui du cerveau réel. Cet échantillon fantôme contenait des fluorophores et des nanoparticules d’or dispersés de manière homogène, ce qui a permis à l’équipe de visualiser et de quantifier clairement comment la forme du faisceau d’appauvrissement se déformait au fur et à mesure qu’il pénétrait plus profondément. Ensuite, ils ont calculé les pré-ajustements nécessaires qui devraient être apportés au faisceau de déplétion en fonction de la profondeur des tissus afin que sa forme finale corresponde davantage à celle idéale. Les ajustements ont été effectués à l’aide de l’optique adaptative, une technologie développée à l’origine par des astronomes pour améliorer les images télescopiques qui souffrent d’aberrations causées par l’atmosphère terrestre.
Une fois la forme du faisceau d’appauvrissement calibrée selon les tests fantômes, les scientifiques ont procédé à l’imagerie du tissu neural vivant. Ils ont comparé les résultats de la microscopie STED régulière, de la microscopie STED corrigée et de la microscopie à deux photons – une technique spécifiquement ajustée pour l’imagerie des tissus profonds. Les résultats ont été assez convaincants : les images STED corrigées ont capturé les détails fins des dendrites neurales plus profondes bien mieux que les images STED standard. « En utilisant notre stratégie d’étalonnage, nous avons pu mesurer des structures neuronales aussi petites que 80 nm à une profondeur de 90 m à l’intérieur du tissu biologique et obtenir une augmentation du signal de 60 pour cent après correction de l’aberration sphérique », explique Nägerl.
Ji Yi, professeur de génie biomédical à l’Université Johns Hopkins, remarque : « La microscopie à super-résolution a été principalement appliquée aux spécimens minces, tels que les cellules à couche unique, où la diffusion de la lumière est négligeable. L’équipe dirigée par Valentin Nägerl a mis en œuvre l’optique adaptative dans un -microscopie à déplétion à émission stimulée par photons (2P-STED), et atteint une résolution de 80 nm de l’imagerie des épines dendritiques des neurones à travers le tissu cérébral de 90 microns. tissu cérébral. » Yi explique que l’avancée facilitera l’étude des activités et des interactions neuronales.
Étant donné que ce nouveau processus d’étalonnage est robuste, simple à mettre en œuvre et relativement peu coûteux, il pourrait être facilement intégré aux pratiques de laboratoire standard pour obtenir de meilleurs résultats avec les microscopes STED, à condition que l’échantillon fantôme préparé corresponde aux propriétés optiques de l’échantillon biologique. À cet égard, Nägerl déclare : « Notre approche ne se limite pas aux échantillons de cerveau ; elle pourrait être adaptée à d’autres tissus avec des indices de réfraction connus et relativement homogènes, ainsi qu’à d’autres types de préparations, même potentiellement dans le cerveau intact et vivant de souris. «
La source:
SPIE – Société Internationale d’Optique et de Photonique
Référence de la revue :
Bancelin, S., et al. (2021) Correction d’aberration en microscopie à déplétion par émission stimulée pour augmenter la profondeur d’imagerie dans le tissu cérébral vivant. Neurophotonique. doi.org/10.1117/1.NPh.8.3.035001.
