Le coronavirus 2 du syndrome respiratoire aigu sévère (SRAS-CoV-2), qui est le virus responsable de la maladie à coronavirus 2019 (COVID-19), est un virus à acide ribonucléique (ARN) à brin positif et enveloppé qui appartient à la famille des Coronaviridae . À ce jour, le SRAS-CoV-2 a infecté plus de 200 millions de personnes et fait plus de 4 millions de morts dans le monde.
Plusieurs vaccins et thérapeutiques sont actuellement disponibles pour la gestion du COVID-19 ; Cependant, des recherches supplémentaires sont nécessaires pour le développement de nouvelles stratégies efficaces pour lutter contre les nombreuses variantes préoccupantes du SRAS-CoV-2 (VoC).
Étude : Une méthode pour la génération de particules virales pseudotypées portant la protéine de pointe du coronavirus du SRAS avec des rendements élevés. Crédit d’image : Blue Planet Studio/Shutterstock.com
Sommaire
Importance de caractériser le SARS-CoV-2
Semblable à celle du SARS-CoV, l’enveloppe du SARS-CoV-2 contient trois protéines structurelles qui incluent les protéines de pointe (S), de membrane (M) et de petite enveloppe (E).
Les chercheurs ont classé la protéine SARS-CoV-2 S comme protéine de fusion virale de classe I. D’autres membres de cette classe comprennent les protéines d’enveloppe de rétrovirus et les protéines d’hémagglutinine du virus de la grippe.
La protéine SARS-CoV-2 S est un homotrimère dont le rôle fonctionnel clé est dans l’interaction du virus avec les récepteurs de la cellule hôte. La protéine S favorise l’entrée du virus dans la cellule hôte par endocytose ou fusion membranaire. La région de la sous-unité S1 de la protéine S se lie au récepteur de l’enzyme de conversion de l’angiotensine 2 (ACE2) sur la cellule hôte.
Ensuite, en présence de sérine 2 de protéase transmembranaire (TMPRSS2) et de furine, la protéine S subit un clivage protéolytique en sous-unités de fusion S1 et S2 au site S1/S2. D’autres sites de clivage situés dans la région S2 sont clivés par des protéases de la cellule hôte telles que les cathepsines, les proprotéines convertases de type furine et la sérine protéase de type trypsine.
Les scientifiques ont affirmé qu’il est extrêmement important de comprendre le rôle de la protéine SARS-CoV-2 S au niveau moléculaire, car cela permettrait de mieux comprendre le mode par lequel le virus pénètre dans la cellule hôte. Cependant, mener cette recherche est difficile car elle nécessite de réaliser des expériences utilisant des virus vivants. Par conséquent, les chercheurs qui mènent ce type d’études doivent respecter les exigences du niveau de biosécurité 3 (BSL-3).
Qu’est-ce qu’un système de pseudovirus ?
Les systèmes viraux pseudotypés jouent un rôle important dans l’étude du mode d’entrée du virus dans les cellules hôtes, ainsi que la caractérisation des protéines de l’enveloppe virale. Les chercheurs ont développé des particules de pseudovirus qui se composent d’un noyau viral de substitution et de protéines d’enveloppe virale analogues au virus d’origine.
Les scientifiques ont réussi à modifier le génome du virus d’origine de telle sorte qu’ils ont supprimé les gènes spécifiques de la virulence pour empêcher la production de virus de descendance infectieux. En utilisant ces virus pseudotypes avirulents, les chercheurs peuvent mener leurs recherches en toute sécurité dans une installation BSL-2 au lieu d’une installation BSL-3 ou BSL-4.
En règle générale, le virus de la stomatite vésiculaire (VSV), qui est un virus à ARN à brin négatif, est utilisé pour générer des systèmes viraux pseudotypés et des virus recombinants pour étudier les protéines structurelles. Lors de l’étude de la protéine S du SRAS-CoV-2 à l’aide du VSV, les chercheurs ont utilisé un protocole de transfection conventionnel pour révéler que la plupart des particules pseudotypées produites par cette méthode manquaient de protéine S.
Une nouvelle étude publiée sur le serveur de préimpression bioRxiv* discute du développement d’un protocole amélioré basé sur des lignées cellulaires capables d’exprimer de manière cohérente les protéines S. Les auteurs de cette étude affirment que le nouveau protocole profiterait énormément aux chercheurs qui souhaitent comprendre le mode d’entrée du SRAS-CoV-2 dans la cellule hôte. Cette recherche contribuerait également au développement de nouveaux agents antiviraux.
Résultats de l’étude
Initialement, les chercheurs espéraient évaluer l’efficacité de chargement des protéines S sur les particules virales pseudotypées du VSV. Ceci a été réalisé en utilisant des cellules HEK293T qui ont généré des virions pseudotypés.
L’analyse par immunofluorescence de ces virions a été réalisée après les avoir colorés avec un colorant carbocyanine lipophile DiI. L’imagerie confocale de fluorescence a montré que seule une petite partie de ces particules contenait la protéine S. La présente étude a révélé que pour la production de particules virales pseudotypées portant une protéine S uniforme, un niveau faible et persistant d’expression de la protéine S est essentiel.
(UNE) Les cellules HEK293T ont été transfectées avec un vecteur d’expression pour la protéine SARS-CoV S et infectées par VSVΔG-G. Le surnageant de culture a été collecté et coloré avec DiI ainsi que soumis à une coloration par immunofluorescence avec des anticorps contre la protéine SARS-CoV S et des anticorps secondaires conjugués à l’Alexa Fluor 488. Les particules virales ont ensuite été adsorbées sur une plaque à base de verre revêtue de polyéthylèneimine et observées avec un microscope confocal à fluorescence. Des images représentatives sont affichées. Barres, 10 m.
(B) Les cellules HEK293T ont été transfectées avec un vecteur d’expression pour la protéine SARS-CoV S marquée par mCherry et infectées avec VSVΔG-G pendant 16 h. Ils ont ensuite été observés avec un microscope à fluorescence pour la détection de la fluorescence mCherry (rouge) et GFP (vert). Des images représentatives sont affichées. La zone encadrée dans le panneau inférieur droit est affichée à un grossissement plus élevé dans les autres panneaux. Barres, 10 m.
(C) Intensités de fluorescence de la GFP et de la mCherry dans des cellules individuelles comme dans (B).
Par la suite, les chercheurs ont isolé les cellules VeroE6 transfectées et ont découvert que tous les produits de particules virales étaient positifs pour la protéine S. Cela a montré que les lignées cellulaires VeroE6 pouvaient produire de manière plus cohérente et stable des particules virales portant la protéine S par rapport aux cellules HEK293T transfectées de manière transitoire. De plus, cette étude quantitative a révélé une quantité significativement plus élevée de particules virales avec la protéine S dans les lignées de cellules VeroE6 stables par rapport aux cellules HEK293T transfectées de manière transitoire.
Dans l’ensemble, le nouveau protocole discuté ici s’est avéré très efficace pour produire des pseudovirus pouvant être utilisés pour étudier le mode d’entrée dans les cellules par le SARS-CoV ou le SARS-CoV-2.
Conclusion
L’étude actuelle a développé avec succès un protocole modifié pour générer des pseudovirus basés sur des lignées cellulaires stables. Les particules virales produites par cette méthode contenaient une grande quantité de protéine S, qui est connue pour jouer un rôle vital dans l’infection par le SRAS-CoV-2. Cette recherche devrait aider au développement de vaccins et de thérapies pour le COVID-19.
*Avis important
bioRxiv publie des rapports scientifiques préliminaires qui ne sont pas évalués par des pairs et, par conséquent, ne doivent pas être considérés comme concluants, orienter la pratique clinique/le comportement lié à la santé, ou traités comme des informations établies.
