Dans une récente étude publiée sur medRxiv* serveur de prétirage, des chercheurs espagnols ont décrit une nouvelle méthode d’enrichissement pour le séquençage métagénomique du virus monkeypox (MPXV).
Le monkeypox humain est une maladie zoonotique originaire des jungles d’Afrique centrale et occidentale et signalée pour la première fois en République démocratique du Congo en 1970. Les singes et les rongeurs propagent la maladie, bien que le réservoir d’origine reste inconnu. Les humains contractent l’infection par le MPXV par contact avec des animaux/humains infectés et des matériaux contaminés. MPXV est un virus enveloppé avec environ 197 kb d’ADN double brin (ds).
MPXV appartient au genre Orthopoxvirus sous la Poxviridae famille des virus à ADN double brin. Le séquençage du génome a identifié deux clades de MPXV : les clades du bassin du Congo (CB) et de l’Afrique de l’Ouest (WA). Le clade CB provoque des maladies graves et une mortalité plus élevée. Généralement, les poxvirus (y compris MPXV) présentent une plus grande tolérance à une large gamme de pH et sont beaucoup plus résistants à la dessiccation que les autres virus enveloppés. De plus, ils sont moins sensibles aux désinfectants que les autres virus enveloppés.
Étude : Une méthode d’enrichissement nouvelle et efficace pour le séquençage métagénomique du virus monkeypox Crédit d’image : NIAID
Sommaire
À propos de l’étude
Dans la présente étude, les chercheurs ont évalué une nouvelle méthode d’enrichissement de l’ADN MPXV par rapport à l’approche sans enrichissement. Des échantillons cliniques de lésions ou d’écouvillons de liquide vésiculaire ont été obtenus et deux échantillons MPXV positifs (MP01 et MP03) ont été sélectionnés. L’extraction de l’ADN a été réalisée par deux protocoles différents.
Dans la première méthode (sans enrichissement), l’ADN a été extrait à l’aide du kit d’isolement d’acide nucléique compact pur MagNA I. Le deuxième protocole a été modifié à partir d’une technique de lyse différentielle à base de saponine et centrifugé à force g élevée (35 000 g). Cette méthode a été conçue pour enrichir les échantillons d’ADN MPXV afin d’éviter de gaspiller le quota de séquençage.
Une étape de centrifugation douce (à faible force g) a été effectuée initialement pour éliminer les grosses particules. L’ADN de l’hôte a été appauvri avec le traitement de la saponine, du chlorure de sodium (NaCl) et de la désoxyribonucléase (DNase). Le NaCl, la DNase et la saponine ont été éliminés pour le séquençage. Les échantillons ont été traités en utilisant les méthodes sans enrichissement (MP01bCHUAC, MP03bCHUAC) et avec enrichissement (MP01CHUAC, MP03CHUAC).
Arbre phylogénomique. Analyse phylogénomique des échantillons de la présente étude, en les comparant à tous les génomes MPXV complets disponibles dans GenBank à ce jour (2022-07-18, 275 génomes du taxid 10244). Cela ne prétend pas déduire l’évolution du virus, seulement localiser les entrées les plus similaires aux échantillons de cette étude. Une bande de couleur indique la lignée de chaque échantillon (A : violet, A.1.1 : jaune, A.2 : vert, B.1 : bleu) et des zones orange mettent en évidence les échantillons de l’étude.
Résultats
Dans les résultats préliminaires via le système de classification taxonomique Kraken 2 utilisant des lectures brutes non filtrées, les auteurs ont noté que la plupart des lectures dans les échantillons enrichis (MP01CHUAC et MP03CHUAC) appartenaient au MPXV, et presque aucune n’était classée comme contamination de l’hôte. En revanche, la plupart des lectures dans les échantillons non enrichis (MP01bCHUAC et MP03bCHUAC) étaient de l’ADN humain.
Lorsque Best Match Tagger (BMTagger) a éliminé la contamination par l’ADN humain, le nombre de lectures pour MP01CHUAC et MP03CHUAC a été réduit de 1 % à 2 %, tandis que la réduction pour MP01bCHUAC et MP03bCHUAC était de 90 % à 95 %. Lors de l’étape suivante de contrôle de la qualité, toutes les lectures non classées comme Orthopoxvirus ont été supprimées. Cela a entraîné des changements moins drastiques et le nombre de lectures a diminué de 30 % pour les échantillons enrichis et de 8 % à 41 % pour les échantillons non enrichis.
Par rapport aux lectures brutes/originales, le nombre de lectures après l’étape finale de contrôle de la qualité a diminué de 50 % pour les échantillons enrichis et de 93 % à 98 % pour les échantillons non enrichis. Les lectures restantes ont été alignées sur une séquence de référence où les lectures d’échantillons enrichis avaient une profondeur médiane de 1500 à 1800, tandis que celles d’échantillons non enrichis avaient une profondeur médiane de 80 à 100.
Néanmoins, tous les échantillons ont produit une séquence consensus de qualité de la lignée MPXV B.1. MP01CHUAC avait une mutation nucléotidique, tandis que MP03CHUAC avait deux substitutions d’acides aminés contre le génome de référence.
conclusion
L’étude a révélé des différences significatives entre les deux protocoles lors de la comparaison de la profondeur et du nombre de lectures. La diminution du nombre de lectures lorsque les lectures de l’hôte ont été supprimées était massive (90 % à 95 %) pour le protocole sans enrichissement, mais marginale (1 % à 2 %) pour le protocole d’enrichissement. De plus, la méthode d’enrichissement a conservé la moitié des lectures après l’étape finale de contrôle de la qualité, tandis que le protocole de non-enrichissement n’a conservé que 2 % à 3 % des lectures d’origine.
Après avoir aligné les lectures nettoyées sur une séquence MPXV de référence, la profondeur médiane était plus élevée pour les échantillons enrichis que pour les échantillons non enrichis. Tous les échantillons ont généré un consensus de bonne qualité basé sur l’alignement, mais la profondeur accrue (avec le protocole d’enrichissement) est essentielle pour faire confiance aux changements génétiques observés.
En conclusion, la nouvelle méthode d’enrichissement a considérablement amélioré l’efficacité du séquençage, le nombre de lectures virales, la profondeur et la fiabilité des séquences consensus. Notamment, la suppression des séquences hôtes avant le séquençage permet l’inclusion de plus d’échantillons par cartouche, réduisant les coûts et le temps de diagnostic et augmentant l’efficacité du séquençage.
*Avis important
medRxiv publie des rapports scientifiques préliminaires qui ne sont pas évalués par des pairs et, par conséquent, ne doivent pas être considérés comme concluants, guider la pratique clinique/les comportements liés à la santé, ou traités comme des informations établies.
