Bien que la majorité des personnes infectées par le coronavirus 2 du syndrome respiratoire aigu sévère (SRAS-CoV-2) restent asymptomatiques, elles sont toujours capables de transmettre le virus aux autres. Outre la prévalence généralisée des porteurs asymptomatiques, la maladie à coronavirus 2019 (COVID-19) peut également être difficile à diagnostiquer, car les personnes asymptomatiques présentent souvent des symptômes similaires à la grippe et à la pneumonie.
Étude: Détection par smartphone PD-LAMP du SARS-CoV-2 sur puce. Crédit d’image : NIAID
Sommaire
Diagnostic de COVID-19
À ce jour, la Food and Drug Administration (FDA) des États-Unis a accordé une autorisation d’utilisation d’urgence (EUA) pour les tests d’amplification d’acide nucléique (TAAN) et les tests sérologiques pour diagnostiquer le COVID-19.
Bien que la réaction en chaîne par polymérase de transcription inverse quantitative (qRT-PCR) soit la référence pour les diagnostics de COVID-19, ce test est une approche à forte intensité de main-d’œuvre qui nécessite des travailleurs qualifiés, un équipement spécialisé et des réactifs coûteux.
Les tests d’amplification isotherme des acides nucléiques (iNAAT) sont une alternative aux tests RT-PCR traditionnels. En raison de la capacité d’amplification de l’ADN sans cycle thermique, les diagnostics basés sur INAAT ne nécessitent pas l’utilisation d’équipements coûteux ou de personnel qualifié. O
Avec des lectures fluorescentes, colorimétriques ou électrochimiques, l’amplification isotherme médiée par la boucle de transcriptase inverse (RT-LAMP) permet une identification sensible, rapide et fiable des acides nucléiques en moins d’une heure. Par rapport à la RT-PCR, la RT-LAMP amplifie l’acide ribonucléique (ARN) spécifique en 109 copies tout en étant plus résistante aux inhibiteurs.
Technologie d’imagerie pour smartphone associée à RT-LAMP
Dans un récent Analytica Chimica Acta étude, les chercheurs décrivent l’utilisation de RT-LAMP en combinaison avec la diffusométrie de particules (PD), qui est une technique d’imagerie par smartphone, pour détecter le SRAS-CoV-2 dans des échantillons de salive brute en 35 minutes avec une limite de détection (LOD) de 30 particules virales/µL.
Dans la présente étude, les auteurs ont utilisé un réchauffeur portable en polyéthylène téréphtalate (PET) recouvert d’oxyde d’indium et d’étain (ITO) pour une amplification isotherme sur puce. Notamment, ITO-PET a déjà été utilisé pour la PCR à flux continu, qui implique diverses zones de chauffage lorsque l’échantillon traverse le dispositif à flux continu et est ensuite évalué à l’extérieur de celui-ci. En créant une PD-LAMP de faible puissance qui permet une amplification isotherme directe sur la puce, les chercheurs éliminent le besoin de transférer l’échantillon à partir d’un tube, réduisant ainsi considérablement le risque de contamination croisée.
Pour une plus grande sensibilité, les auteurs ont créé de nouvelles amorces qui ciblent la protéine non structurelle 3 (nsp3), qui est une région conservée au sein du SARS-CoV-2 ORF1ab gène. Ces amorces ont ensuite été combinées avec d’autres amorces qui ciblent la région N2 du gène de la nucléocapside (N) du SRAS-CoV-2.
Prises ensemble, ces amorces sont capables d’amplifier l’ARN génomique en moins de 30 minutes sans amplification négative. L’expérience a été exécutée cinq fois pendant 30 minutes à chaque fois, donnant une limite de détection de 75 copies d’ARN génomique (ARNg) par réaction.
Résultats de l’étude
Les chercheurs ont d’abord confirmé que leur système PD-LAMP ne provoquait pas de réaction croisée significative avec d’autres virus. Surtout, les chercheurs ont observé que la viscosité de la salive minimise le coefficient de diffusion de la solution, ce qui fait varier l’amplification RT-LAMP entre les échantillons.
En conséquence, avant de tester sur puce, les chercheurs ont amplifié l’ARN guide du SRAS-CoV-2 (ARNg) dans un tube et utilisé l’électrophorèse sur gel pour la validation secondaire afin d’identifier la concentration la plus élevée de salive pouvant être utilisée dans un test RT-LAMP. . Ces études ont confirmé que la salive pouvait être ajoutée lors d’une finale à des concentrations finales de 8 % et 10 % dans la réaction de 20 µL.
Le SRAS et le MERS, qui ont agi comme témoins négatifs, ont été ajoutés à la réaction à une concentration finale de 1,6×104 particules virales/20 µL de réaction. Comparativement, des particules de virus SARS-CoV-2 ont été ajoutées à une concentration finale de 5×103 – 5×101 particules virales/réaction de 20 µL pour les tests sur puce. Les puces ont été chauffées dans le réchauffeur ITO-PET pendant 35 minutes avant d’être examinées à l’aide de PD. Par rapport aux échantillons positifs, une variation significative a été observée entre les témoins et les échantillons positifs.
Pour les 8 % et 10 % de salive, la PD a donné un coefficient de diffusion réduit pour les échantillons positifs par rapport aux témoins négatifs, démontrant ainsi que RT-LAMP a créé avec succès des amplicons pour les échantillons positifs sur puce afin de détecter avec précision la présence de SARS-CoV-2 . En fait, la détection du SARS-CoV-2 avec PD-LAMP a donné une LOD de 50 particules/20 µL de réaction dans les échantillons de salive à 8 % et 10 %.
Conséquences
Les résultats de l’étude actuelle démontrent l’application diagnostique de leur technologie PD-LAMP sur une plate-forme chauffante portable ITO-PET.
Même si d’autres virus infectieux sont présents dans l’échantillon, cette application pour smartphone est capable de confirmer qu’un échantillon donné est négatif pour le SRAS-CoV-2. De plus, les chercheurs ont démontré que leur technologie RT-LAMP pouvait atteindre avec succès des niveaux de détection comparables à ceux obtenus par RT-PCR.
