Dans une récente étude publiée sur bioRxiv* serveur de préimpression, les chercheurs ont proposé un système optimal pour générer des particules de type virus (VLP) du coronavirus 2 du syndrome respiratoire aigu sévère (SRAS-CoV-2) pour examiner l’assemblage viral et l’entrée dans les cellules hôtes cibles.
Sommaire
Contexte
Les VLP sont des structures multi-protéines-lipides non infectieuses qui imitent la conformation d’un virus natif et pourraient être utilisées pour produire des vaccins candidats efficaces et bon marché contre la maladie à coronavirus 2019 (COVID-19). De plus, les VLP non infectieuses ont permis d’examiner l’entrée et l’assemblage du SRAS-CoV-2 dans les installations de niveau de biosécurité 2 (BSL-2).
Le SRAS-CoV-2, l’agent causal du COVID-19, est un virus enveloppé d’acide ribonucléique (ARN) composé de 29 protéines structurelles. Les quatre principales protéines structurelles – membrane (M), nucléocapside (N), enveloppe (E) et protéines de pointe (S) s’assemblent pour former des particules SARS-CoV-2 de 100 nm.
Plusieurs rapports ont suggéré que les différentes combinaisons des protéines M, N, E et S jouent un rôle crucial dans la formation des VLP. Les chercheurs ont établi plusieurs systèmes minimaux pour la production de SARS-CoV-2 VLPs ; cependant, à ce jour, une proportion optimale de protéines structurelles du SRAS-CoV-2 à utiliser dans de tels systèmes n’a pas été déterminée ni testée.
À propos de l’étude
Dans la présente étude, les chercheurs ont utilisé un rapport de plasmide transfecté optimal des protéines M, N, E et S imitant les rapports d’ARN du SRAS-CoV-2 pour obtenir des VLP du SRAS-CoV-2 composés de protéines structurelles M, N, E et S .
Ils ont dérivé les rapports d’ARN du SRAS-CoV-2 à partir de l’analyse transcriptomique du génome du SRAS-CoV-2 dans les cellules pulmonaires infectées Calu3/Caco2 intestinales et les cellules pulmonaires humaines A549hACE2. Ils ont également optimisé la production de VLP fluorescentes (bicolores ou monocolores) marquées avec des protéines structurelles du SRAS-CoV-2 pour visualiser l’entrée des particules virales dans les cellules hôtes à l’aide de la microscopie confocale quantitative.
En outre, ils ont caractérisé ces VLP à l’aide de techniques microscopiques avancées pour déterminer le nombre, la taille et la morphologie des VLP comparables aux particules SARS-CoV-2 de type sauvage (wt). Ils ont utilisé une suite de techniques microscopiques, y compris la spectroscopie de corrélation de fluctuation (FCS), la microscopie à fluorescence à réflexion interne totale (TIRF-M), la microscopie de localisation photo-activable (PALM) et la microscopie à force atomique à fluorescence corrélative (AFM) pour l’analyse.
Résultats de l’étude
L’analyse de séquençage d’ARN (RNAseq) a montré qu’un rapport plasmidique de 3:12:2:5 pour M:N:E:S augmentait la production de VLP de 1,5 fois pour les VLP composées de MNE et de MNES. Comparativement, le rapport 3:3:3:5 pour M:N:E:S avec plus d’incorporation de S et plus de S2 mature sur les VLP, imitait le virus wt.
Les résultats de l’AFM ont confirmé que ces particules virales étaient des VLP et non des exosomes ou des vésicules extracellulaires (EV). L’immunospotting sur la protéine fluorescente verte (GFP)-VLP a montré moins de 5 % ou aucune colocalisation entre les VLP et les véhicules électriques marqués avec un marqueur de différenciation 81 (CD81), suggérant que les VLP sortent par une voie de sécrétion distincte.
Les auteurs ont mesuré les VLP MNES de taille 126 ± 17 nm en utilisant l’AFM. Ils ont produit des VLP composées de protéines M ou N en fusion avec des protéines fluorescentes ; Curieusement, non seulement les VLP du SRAS-CoV-2 ont toléré l’incorporation de protéines marquées M et N fluorescentes, mais ce marquage n’a pas tempéré l’assemblage des particules virales. Cela a aidé les chercheurs à établir l’incorporation du S mature dans les VLP fluorescentes. Ensuite, en utilisant FCS et PALM, ils ont trouvé une plage de tailles de particules de 100 à 110 nm pour les VLP MNE et de 130 nm pour les VLP MNES, conformément aux résultats de l’AFM.
Les résultats du FCS ont montré deux sous-ensembles des tailles MNE et MNES VLP : un supérieur à 100 nm et un égal à 100 nm de diamètre, suggérant que le SARS-CoV-2 produisait des particules avec et sans S, comme observé également par immunospotting.
Les résultats d’immunospotting ont confirmé qu’au moins 25 % des VLP M(GFP)NES incorporaient la protéine S. Selon les auteurs, il serait intéressant de faire varier le ratio d’expression de S dans les cellules expérimentales pour voir si cela modifierait le niveau d’incorporation de S dans les VLP. De même, l’incorporation de MNES VLP imitant le SRAS-CoV-2 dans des modèles animaux pourrait fournir des quantités suffisantes de réponses d’anticorps neutralisants sans être infectieux.
Enfin, à la surface des cellules pulmonaires humaines, les VLP M(GFP)NES ont pu reconnaître le récepteur de l’enzyme de conversion de l’angiotensine humaine 2 (hACE2) et s’endocytoser, confirmant que le S incorporé dans les VLP est resté fonctionnel.
conclusion
Dans l’ensemble, les résultats de l’étude ont réaffirmé que les VLP non fluorescents et fluorescents composés des protéines SARS-CoV-2 M, N, E et S pourraient emballer l’ARN du SARS-CoV-2 pour transduire et exprimer des gènes dans les cellules hôtes cibles.
De plus, leur production optimale et leur caractérisation détaillée pourraient aider à comprendre les mécanismes sous-jacents de l’assemblage du SRAS-CoV-2 et de l’entrée de la cellule hôte dans un environnement sûr (BSL-2 et non BSL-3) et même aider au développement de VLP Vaccins contre le covid19.
*Avis important
bioRxiv publie des rapports scientifiques préliminaires qui ne sont pas évalués par des pairs et, par conséquent, ne doivent pas être considérés comme concluants, guider la pratique clinique/les comportements liés à la santé, ou traités comme des informations établies.
