Dans une récente étude publiée sur bioRxiv* serveur de préimpression, les chercheurs ont élucidé les mécanismes sous-jacents de l’activité du motif tripartite contenant 7 (TRIM7) contre le coxsackievirus et le norovirus.
TRIM7 est une protéine qui accélère l’ubiquitination du substrat et possède des propriétés antivirales ; cependant, le mécanisme de l’inhibition virale n’est pas bien caractérisé, c’est-à-dire que TRIM7 se lie directement aux protéines virales et les dégrade ou s’il a des effets antiviraux indirects en activant les voies immunologiques n’est pas connu.
Étude : TRIM7 limite l’infection par le virus Coxsackie et le norovirus en détectant la glutamine C-terminale générée par le traitement de la protéase 3C. Crédit d’image : Juan Gaertner/Shutterstock
À propos de l’étude
Dans la présente étude, des chercheurs du Laboratoire MRC de biologie moléculaire de l’Université de Cambridge et du Francis Crick Institute ont décrit les mécanismes utilisés par TRIM7 pour interagir avec de multiples substrats et limiter les infections à coxsackie et à norovirus en dégradant leurs protéines.
Des expériences de liaison par calorimétrie de titrage isotherme (ITC) ont été réalisées à l’aide de protéines recombinantes pour sonder les interactions TRIM7-PRYSPRY avec la glycogénine-1 de lapin (rbGYG1), un ligand TRIM7. Des peptides correspondant aux hélices de glycogénine ont été synthétisés. L’épitope GYG lié à TRIM7 a été identifié (épitope GYG322-333), après quoi l’équipe a recherché une séquence identique dans d’autres ligands de TRIM7. Pour étudier si le motif C-terminal de la glutamine (Q) est reconnu par TRIM7, ce qui pourrait expliquer la liaison non sélective de TRIM7, les peptides correspondant aux C-terminaux de CVB3 2BC, RACO-1, calicivirus murine norovirus (MNV) protéines non structurales (NS) 3,6 ont été synthétisés.
De plus, un peptide correspondant au GYG1 humain (hGYG1) a été synthétisé pour des évaluations comparatives. Les auteurs ont cherché à savoir si TRIM7 accueillait le résidu R385 et des analyses de fluorimétrie différentielle à balayage ont été effectuées pour évaluer les interactions de TRIM7 avec les peptides 2BC. Pour déterminer si les résidus peptidiques FQ et LQ étaient adéquats pour la liaison, LQ a été comparé à ac-LLQ et ac-LQ, après quoi la liaison du peptide polyA avec les résidus LQ a été évaluée.
Pour évaluer les altérations des affinités de liaison, MBP-TRIM7-CC-PRYSPRY (CC-PS) a été produit, dont la liaison a été comparée à celle du peptide GYG338-350 et d’une molécule comprenant l’isoforme GN1 humaine de GYG1. Plus loin, in vitro Des expériences d’ubiquitination ont été réalisées. Des expériences de décharge ont été réalisées pour évaluer la cinétique de l’ubiquitine.
De plus, plusieurs constructions HA-TRIM7 ont été surexprimées dans les cellules 293T pour évaluer l’activité de RING dans les cellules et les protéines de pleine longueur. L’équipe a étudié si la liaison de TRIM7 aux substrats helix-FQ conduirait à une dégradation cellulaire, pour laquelle les cellules ont été co-transfectées avec des plasmides codant pour les constructions EGFP-GYG1 (Q333A et WT) et les constructions mCherry-Trim7 (mCh-T7) (R385A et WT). Les protéines cellulaires ont été quantifiées par immunotransfert et microscopie à fluorescence.
Déterminer si les effets antiviraux étaient dus à la liaison médiée par la protéase 3C (3Cpro) et à la dégradation des protéines virales ayant les terminaisons C de l’hélice-FQ ou dues à la signalisation immunologique activée dans les cellules surexprimées par TRIM7. Des expériences ont été réalisées avec des expressions croissantes de TRIM7 avec des protéines antivirales telles que TRIM5 et 21. Des cellules HeLa exprimant CD300lf (récepteur MNV1) et TRIM7 ont été utilisées pour des analyses d’infection à l’aide de WT MNV1 et CVB3-GFP. Les cellules HeLa qui restreignaient CVB3 et MNV1 ont été transduites avec l’enzyme de conversion de l’angiotensine humaine 2 (hACE2) pour déterminer si TRIM7 pouvait inhiber l’activité SARS-CoV-2 Omicron BA.1.
Résultats
Clivage par 3C-pro des protéines des virus à ARN à brin positif (Coronaviridés, Picornaviridéset Caliciviridae familles) ont conduit à la génération de glutamines C-terminales, qui étaient des substrats pour l’activité de TRIM7. Par conséquent, TRIM7 pourrait inhiber les activités des norovirus et des coxsackievirus. Des protéines telles que RACO-1, CVB3 2BC et GYG1 et le domaine PRYSPRY étaient liées à TRIM7 puisque toutes contenaient des terminaux C se terminant par des motifs degron hélice-FQ. CVB3 et MNV1 contenaient respectivement huit et deux protéines qui se terminaient par des résidus de glutamine (Q).
Par conséquent, le motif hélice-FQ était une nécessité structurelle pour permettre l’inhibition médiée par TRIM7 des norovirus et des virus coxsackie. De plus, TRIM7 perdrait son activité d’inhibition virale s’il n’était pas lié aux motifs glutamine créés par le clivage de la protéine médiée par 3Cpro. Cependant, TRIM7 n’a pas pu restreindre le SRAS-CoV-2.
En outre, l’expression tissulaire et la régulation génique incohérentes de TRIM7 avec TRIM5 et 21 ont indiqué que la restriction virale médiée par TRIM7 pouvait être considérée comme un artefact de surexpression. La région CIV de GYG était nécessaire pour la liaison TRIM7-GYG. Les mutants R385A, N383A, Q436A et F426 ont aboli la liaison du peptide TRIM7 ; cependant, le mutant T384A a montré une liaison avec une affinité moindre.
Les ponts salins bidentés formés avec le résidu R385 par les acides carboxyliques des peptides étaient nécessaires pour la liaison de TRIM7, et les interactions entre les chaînes latérales de glutamine et les résidus Q436 de TRIM7 étaient essentielles pour le positionnement des terminaux carboxy pour la liaison de R385. Le mutant T323A n’a pas modifié la liaison, ce qui indique que T323A pourrait modifier l’aptitude virale indépendamment de TRIM7.
TRIM7 pourrait interagir avec des protéines avec des résidus terminaux FQ ou LQ. Les résidus ac-LQ et ac-LLQ étaient liés à TRIM7, alors que polyA n’a pas démontré de liaison. Dans les expériences d’ubiquitination, TRIM5, 7 et 21 ont montré un comportement similaire, indiquant que la polyubiquitine K63 pouvait modifier TRIM7. La formation de points ponctués a été observée dans mCh-T7 et EGFP-GYG1, ce qui correspond aux corps cytoplasmiques formés par TRIM. Les niveaux d’EGFP-GYG1 étaient trois fois plus élevés en l’absence de liaison TRIM7. Les effets antiviraux de TRIM7 dépendaient de la liaison et de la dégradation des protéines virales.
Dans l’ensemble, les résultats de l’étude ont montré que TRIM7 cible les motifs hélice-FQ C-terminaux pour se lier directement aux protéines virales et les dégrader, et l’inhibition virale a été activée par la détection de résidus de glutamine créés par le clivage des protéines médiées par 3Cpro.
*Avis important
bioRxiv publie des rapports scientifiques préliminaires qui ne sont pas évalués par des pairs et, par conséquent, ne doivent pas être considérés comme concluants, guider la pratique clinique/les comportements liés à la santé, ou traités comme des informations établies.
